Определение пигментов и желчных элементов в моче

Нормальные пигменты: уробилин и уробилиноген

Соответствующая норме свежесобранная моча содержит лишь уробилиноген, переходящий при окислении в присутствии света в уробилин. Поэтому в свежей моче следует искать уробилиноген, а в моче, сохраненной в течение нескольких часов – уробилин. На практике оба эти вещества определяются одновременно либо как уробилин, либо как уробилиноген.

Исследование уробилина реактивом Шлезингера

Реактив: Раствор ацетата цинка 10% в спирте 95°. Перед употреблением реактив энергично встряхивают.

Техника. В пробирку берут 5 мл мочи и равный объем спиртного раствора ацетата цинка 10%, затем добавляют 1 каплю йодного раствора 3% в спирте для окисления уробилиногена в уробилин. Слегка встряхивают и оставляют в покое до следующего дня, затем фильтруют. В присутствии уробилина фильтрат дает зеленую флюоресценцию.

Примечание. Реакция менее чувствительна в присутствии альбумина, удерживающего часть пигментов. Желчные пигменты препятствуют выявлению уробилина, и в случае необходимости их надо предварительно удалить осаждением. К 20 мл мочи добавляют 2 мл хлористого кальция 10% или хлористого бария 10% и 2 мл аммиака; встряхивают и фильтруют, фильтрат подкисляют уксусной кислотой и затем используют для исследования уробилина.

Исследование уробилиногена реактивом Эрлиха

Реактив Эрлиха: растворяют 2 г п-диметиламинобензальдегида в 100 мл соляной кислоты 20% (приготовленной, смешивая 80 мл концентрированной соляной кислоты 25%, уд. вес = 1124 с 20 мл дистиллированной воды).

Техника. В пробирку берут 4–5 мл свежевыделенной мочи, затем добавляют 3–4 капли реактива Эрлиха. Если спустя 1–2 минуты красный цвет не появляется, то пробирку нагревают на водяной бане при 50–60°. Уробилиноген повышен, если окраска появляется без нагревания. Если окраска появляется после нагревания, то уробилиноген соответствует норме. И наконец, уробилиноген понижен или отсутствует, если окраска не появляется даже при нагревании.

Примечание. Возможно присутствующий билирубин отделяют растворением в хлороформе: добавляют 2 мл хлороформа и встряхивают реактив Эрлиха дает красный цвет также с рядом других продуктов как например, с белками, индиканом, индолом, скатолом, некоторыми лекарственными средствами, что снижает ценность этой реакции. Более специфичным является реактив Шлезингера.

Определение общего уробилина (уробилин и уробилиноген)

Принцип. Уробилин дает с ацетатом цинка зеленую флюоресценцию которую сравнивают с флюоресценцией стандартного раствора трипафлавина.

Реактивы:

1. Йод 3% в спирте 95°.
2. Ацетат цинка.
3. Раствор трипафлавина 10 мг в дистиллированной воде. В момент употребления разбавляют 1/1, получая таким образом, раствор трипафлавина 5 мг °/00, 1 мл которого соответствует 0,000 613 мг уробилина.
4. Отвешивают 25 г ацетата цинка и 79 г ацетата натрия., добавляют 4 мл соляной кислоты (уд. вес = 1,19) и затем растворяют в 1 ООО ад этилового спирта 60 % в мерной колбе.

Техника. К 5мл мочи добавляют 2 капли раствора йода 3% (1), и несколько кристаллов ацетата цинка (2), затем дополняют до 10 мл дистиллированной водой. Оставляют в покое на 30 минут, фильтруют, после чего флюоресценцию сопоставляют с разбавленным стандартным раствором типафлавина 5 мг °/ 00 (3).

Сопоставление производят помещая обе пробирки перед экраном с двумя отверстиями диаметром 6–8 мм, позади которого расположен источник света, проходящий через отверстие экрана и используемый для исследования пробирок.

Расчет. Если обе флюоресценции одинаковы: уробилин мг/л = 0,000 613 Х200 = 1,226 мг/л.

Если флюоресценция мочи более сильная, то фильтрат разбавляют до выравнивания флюоресценции известным количеством раствора (4), затем умножают вышеприведенный результат на степень разбавления.

Патофизиологические изменения. Нормальная моча, собранная за сутки, содержит лишь небольшие количества уробилина: 0,2–0,6 мг.

Из кишечника уробилиноген поступает через воротную вену в печень, где часть его превращается в прямой билирубин, а другая часть проходит через печень, достигая большого круга кровообращения, а отсюда в почки, удаляясь из организма вместе с мочой, где он быстро окисляется в контакте с воздухом, переходя в уробилин. Таким образом можно заключить, что в случае полной закупорки печеночного канала или желчного протока, когда желчь уже не попадает в кишечник, уробилиген и уробилин отсутствуют в моче. Кроме того уробилиноген исчезает из мочи при наличии почечных камней с полной закупоркой.

Повышенные уробилинурии (до 40 мг/сутки) наблюдаются при: недостаточности печени (циррозе, желтой атрофии печени, гепатите, сифилисе печени, отравлениях спиртом или хлороформом), при интенсификации процессов гниения в толстой кишке, гемолитических анемиях, некоторых инфекционных болезнях (брюшной тиф, грипп, ревматизм, дифтерия и др.).

Кровяные пигменты

Кровяные пигменты представлены гемоглобином, который может находиться в моче в двух видах: гемоглобин, содержащийся в красных шариках, и свободный гемоглобин. В первом случае при микроскопическом исследовании мочевого осадка обнаруживаются эритроциты, в то время, как во втором случае осадок не содержит эритроцитов.

Исследование кровяных пигментов в моче можно проводить тремя методами:

1. Спекроскопически, учитывая, что гемоглобин отличается характерным абсорбционным спектром.
2. Микроскопически, исследуя мочевой осадок, если моча содержит эритроциты.
3. Химическими методами, выявляющими железное ядро (гематин) в структуре гемоглобина. Так как гематин обладает пероксидазовым свойством, он разлагает перекись водорода, выделяя атомный кислород, окисляющий реактив, вследствие чего цвет этого последнего изменяется.

Метод Адлера

Реактивы:

1. Чистый бензидин.
2. Ледяная уксусная кислота.
3. Перекись водорода 12% об.

Техника. К 2 мл мочи добавляют щепотку бензидина (1) и 10–15 капель ледяной уксусной кислоты (2). Энергично встряхивают, затем добавляют несколько капель перекиси водорода 12 % (3). В присутствии кровяных пигментов появляется окраска, переходящая от зеленого к синему в результате окисления бензидина гемоглобином в присутствии перекиси водорода.

Примечание. Рекомендуется проводить реакцию Адлера с мочевым осадком непосредственно в центрифужной пробирке, и если реакция положительна, необходимо исследовать также и альбумин, в основном сопровождающий гематурию или геморрагию мочевых путей.

Метод Вебера

Реактивы:

1. Ледяная уксусная кислота.
2. Серный эфир.
3. Перекись водорода 12% об.
4. Спиртный раствор гваяковой смолы: разбавляют 0,5 г  размельченной в ступке гваяковой смолы в 25 мл спирта 95°.

Техника. В разделительную воронку берут 10 мл мочи, добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты (1) и 10 мл серного эфира (2). Встряхивают и отделяют эфирный экстракт, который промывают в той же воронке несколькими миллилитрами дистиллированной воды.

Берут 5 мл мочи со слабокислой реакцией (в случае необходимости подкисляют ледяной уксусной кислоты) и предварительно прокипяченной для уничтожения органических пероксидаз, или 5 мл вышеуказанного эфирного экстракта и добавляют 2 мл перекиси водорода 12% (3), затем 5–10 капель свежего раствора гваяковой смолы 2% (4). В присутствии крови появляется темно-синий цвет в результате окисления гваяка гемоглобином в присутствии перекиси водорода.

Метод Мейера

Реактивы:

1. Реактив Мейера приготовляется обычным способом.
2. Перекись водорода 12% об.

Техника. Берут 3 мл мочи и доводят до кипения для уничтожения органических пероксидаз, затем добавляют 3 мл реактива Талмон-Сарду (смешивают 2 мл ледяной уксусной кислоты с 98 мл спирта 90°), 1 мл реактива Мейера и 3 капли перекиси водорода 12%. В присутствии кровяных пигментов на границе раздела между обеими жидкостями в менее чем 2 минуты появляется красное кольцо, вследствие окисления бесцветного фенолфталеина в щелочной среде гемоглобином в присутствии перекиси водорода.

Примечание. Добавление реактива Тальмон-Сарду необходимо для того, чтобы избежать торможение окисления фенолфталеина присутствующими в моче веществами.

Для выявления наличия кровяных пигментов во время работы следует пользоваться очень чистой посудой, так как реакции, будучи весьма чувствительными, малейший след крови может дать неправильный результат. Пробирки, в которых собирали кровь или центрифужные пробирки, использованные для центрифугирования крови, могут применяться только после тщательного промывания водой и выдерживания в течение 24 часов в сульфохромной смеси.

Одной из точных реакций для выявления присутствия кровяных пигментов в крови является получение кристаллов хлоргидрата гематеина (гемина).

К 5 мл мочи добавляют 2–3 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты (1,2%), содержащего ледяную уксусную кислоту 1%. Слегка встряхивают и центрифугируют, затем осадок наводят на стеклянную пластинку, добавляя 1 каплю раствора хлористого натрия 0,10%0. Выпаривают и покрывают покровным стеклом, затем осторожно, с помощью пипетки Пастера за счет капиллярности между пластинкой и покровным стеклом, вводят небольшое количество ледяной уксусной кислоты. Пластинку слегка нагревают над горелкой до почти полного испарения уксусной кислоты не доводя однако последнюю до кипения. Нагревание прекращают, Когда кровяная масса под покровным стеклом еще находится во влажном состоянии. Оставляют для охлаждения, затем исследуют под микроскопом. В присутствии кровяных пигментов наблюдаются темные ромбоэдрические кристаллы хлоргидрата гематеина (кристаллы Тейхмана).

Желчные пигменты

Обычно, присутствие желчных пигментов окрашивает мочу в зеленовато-желтый или темно-бурый цвет, напоминающий черное пиво с желтой пеной, благодаря красно-бурому билирубину, весьма легко превращающемуся в результате окисления в зеленый биливердин.

Исследование билирубина

Метод Поппера

Принцип. Окисление билирубина в биливердин.

Реактив Поппера: растворяют 12 г йодистого калия и 75 г хлористого натрия в 3,5 мл йодной настойки 10%, 125 мл спирта 95° и 525 мл дистиллированной воды.

Техника. Берут 10 мл мочи и осторожно добавляют 3 мл реактива Поппера таким образом, чтобы он стекал на дно пробирки, избегая смешения обеих жидкостей. Образование зеленоватого кольца биливердина на границе между обеими жидкостями указывает на присутствие билирубина.

Примечание. Реакция является весьма чувствительной, даже при наличии следов билирубина.

Реактив Поппера можно заменить раствором йода 6% в спирте 95° (метод Росина) или раствором Люголя (1 г йода и 2 г йодистого калия, растворенных в 50 мл дистиллированной воды). Недостатком этих растворов является однако то, что иногда они смешиваются с мочой, вследствие чего не получается четкой границы раздела обеих жидкостей.

Метод Гмелина

Принцип. Тот же, что и при методе Поппера.

Реактив. Азотно-азотистая кислота, полученная в результате воздействия света на обычную азотную кислоту.

Техника. В пробирку берут 10 мл мочи и с помощью пипетки Пастера впускают на дно пробирки 2–3 мл азотно-азотистой кислоты таким образом, чтобы обе жидкости не смешивались. В присутствии желчных пигментов на границе раздела жидкостей появляется ряд колец, окрашенных в зеленый, синий, фиолетовый и красный цвет, в зависимости от степени окисления билирубина.

Метод Гримберга

Принцип. Билирубин осаждают раствором хлористого бария.

Реактивы.

1. Хлористый барий 10%.
2. Соляная кислота: к 95 мл спирта 90% добавляют 5 мл концентрированной соляной кислоты.
3. Перекись водорода 10% об.

Техника. В центрифужную пробирку берут 10 мл мочи, добавляют 5 мл хлористого бария 10% (1), встряхивают и получают осадок фосфата сульфата и возможно билирубината бария. Центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют, осадок взвешивается в 10 мл дистиллированной воды, снова центрифугируют дистиллированной водой, снова центрифугируют и удаляют промывочную воду, затем добавляют 5 мл солянокислого спирта (2), растворяющего осадок. Погружают в кипящую баню на одну минуту. В отсутствии билирубина жидкость остается бесцветной. В присутствии желчных пигментов спиртная жидкость окрашивается в синевато-зеленый или темно-зеленый цвет. Если спирт приобретает бурый и неясный цвет, то это указывает на неполное окисление желчных пигментов. В этом случае добавляют 2 капли перекиси водорода 10% (3), и затем снова погружают на одну минуту в водяную баню.

Если присутствует билирубин, то зеленая окраска появляется немедленно. Если бурый цвет жидкости остается устойчивым, это связано с наличием бурых пигментов, происходящих за счет разрушения желчных пигментов в сохраняемой долгое время моче.

Реакция отличается высокой чувствительностью.

Метод Фуше

Принцип тот же, что и для метода Гримберга.

Реактивы:

1. Хлористый барий 10%.
2. Реактив Фуше.

Техника. В пробирку берут 10 мл мочи, добавляют 5 мл раствора хлористого бария 10% (1), хорошо встряхивают и фильтруют. Затем фильтр развертывают и кладут на сухую фильтровальную бумагу, после чего к осадку добавляют 1–2 капли реактива Фуше (2). В присутствии пигментов на этом месте контакта появляется зелено-синий цвет.

Метод Ионеску-Матиу

Принцип: тот же, что и при методе Гримберга.

Реактивы.

1. Хлористый барий 10%.
2. Реактив Ионеску-Матиу. Смешивают 20 мл серной кислоты 20% с 80 мл раствора бихромата калия 4%.

Техника. К 5 мл мочи добавляют 10 мл раствора хлористого бария 10% (1), встряхивают и фильтруют. Затем осадок промывают несколькими литрами дистиллированной воды и непосредственно на фильтровальную бумагу добавляют от времени до времени по 1 капле реактива (2). В случае присутствия желчных пигментов на соответствующем месте появляется ряд концентрических зон, окрашенных в зеленый цвет.

Желчные соли

В моче больных желтухой можно наблюдать обе желчные кислоты желчи в виде натриевых солей: таурохолат и гликохолат натрия.

Реакция Хэй

Принцип. Желчные соли обладают свойством понижать поверхностное напряжение мочи.

Техника. В конический стакан берут 20–30 мл мочи, затем на ее поверхность просеивают через марлю сухой и тонко размельченный порошок серы. Если моча содержит желчные соли, то сера оседает на дно стакана в течение не более 5 минут. В противном случае сера продолжает плавать на поверхности мочи. Реакция не является специфической, так как спирт, хлороформ, салициловая, уксусная и другие кислоты также снижают поверхностное напряжение мочи.

Реакция Петенкофера

Принцип. Холаловая кислота, получающаяся в результате раздвоения желчных кислот дает с фурфуролом красно-фиолетовую окраску.

Реактивы.

1. Абсолютный спирт.
2. Серный эфир.
3. Животный уголь.
4. Серная кислота.
5. Раствор сахарозы 1%.

Техника.

а) Экстрагирование желчных солей. На водяной кипящей бане выпаривают 200 мл мочи до получения сухого остатка, растворяемого в абсолютном спирте (1), который затем фильтруют. К фильтрату добавляют эфир (2), осаждающий желчные соля. Снова фильтруют, осадок растворяют в дистиллированной воде, встряхивют раствор с животным углем (3) и фильтруют в третий раз.

б) Появление окраски. К фильтрату медленно добавляют 2-4 мл серной кислоты {4) таким образом, чтобы температура не превышала 60°, а затем 3–4 капли раствора сахарозы 1%. (5). В присутствии желчный солей появляется красно-фиолетовый цвет.

Реакция является специфической и весьма чувствительной, будучи положительной даже при наличии 0,20 г/л желчных солей.

Примечание: Реакцию можно проводить также и прямо на моче: в широкую пробирку берут 4 мл разбавленной серной кислоты (2 объема кислоты: 1 объем дистиллированной воды) и 1 мл мочи, затем на поверхность смеси осторожно приливают 3 капли раствора сахарозы 5%, слегка помешивают стеклянной палочкой верхнюю часть жидкости, и затем оставляют 3–4 часа в покое при комнатной температуре. По истечении этого времени в присутствии желчных солей появляется характерное красно-фиолетовое кольцо.

Желчные соли постоянно сопровождают билирубин при механической желтухе, где их количество постепенно увеличивается, если закупорка продолжается в течение более значительного промежутка времени. При гемолитической желтухе моча не содержит ни пигментов, ни желчных солей, а повышенное количество уробилина.