Определение протромбина в крови

Оснащение рабочего места

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

1. Штативы.
2. Микропипетки.
3. Пипетки градуированные на 1 мл.
4. Центрифужные пробирки простыв и мерные.
5. Агглютинационные пробирки.
6. Капилляры Панченкова.
7. Пастеровские пипетки.
8. Водяная баня.
9. Термометры.
10. Секундомеры.
11. Центрифуга.
12. Щавелевокислый натрий (оксалат натрия).
13. Хлористый кальций (CaCl2).
14. Тромбопластин Ленинградского института переливания крови.
15. Хлористый натрий.
16. Дистиллированная вода.

Для исследования также необходима плазма крови.

Определение протромбина по методу Ленинградского института переливания крови

Сущность реакции заключается в том, что протромбин в присутствии тромбопластина и ионов кальция переходит в тромбин (активный фермент), который воздействует на фибриноген, переводя его в фибрин. По времени образования фибрина, выпадающего в виде зернышек или нитей, судят об активности протромбина в исследуемой крови.

Для данного метода используют следующие реактивы:

1. 0,1 М раствор оксалата натрия: 1,34 г оксалата натрия растворяют в воде, в колбе на 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки.
2. 3% раствор оксалата натрия: 3 г оксалата натрия растворяют водой в колбочке на 100 мл и доливают дистиллированной водой до метки.
3. 0,025 М раствор хлористого кальция: 0,277 г химически чистого плавленного хлористого кальция растворяют водой в колбочке на 100 мл и доливают водой до метки.
4. Суспензия тромбопластина: на торзионных или аналитических весах взвешивают 50 мг тромбопластина, переносят его в фарфоровую ступку и тщательно растирают с 5 мл дистиллированной воды до получения однородной суспензии. Из фарфоровой ступки суспензию тромбопластина переливают в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при 1000 об/мин. Надосадочную мутную жидкость отсасывают с помощью пастеровской пипетки в сухую пробирку и используют для реакции. Суспензию тромбопластина готовят перед постановкой исследования.
5. Физиологический раствор (0,85% раствор хлористого натрия).

Техника определения

В штатив устанавливают одну центрифужную и несколько агглютинационных пробирок. Пипеткой Папченкова набирают до метки «0» («К») 0,1 М раствор оксалата натрия и выливают в центрифужную пробирку. Затем на предварительно обработанный спиртом и эфиром палец наносят каплю 3% раствора оксалата натрия и через эту каплю делают укол иглой для прокола кожи. Пипеткой Панченкова (той же, которой был набран и помещен в центрифужную пробирку 0,1 М раствор оксалата натрия) набирают 4 раза кровь из пальца до метки «0» («К») и выливают в центрифужную пробирку с 0,1 мл 0,1 М раствора оксалата натрия. Кровь с реактивом тщательно смешивают и центрифугируют при 1500-2000 об/мин в течение 5-10 минут. Надосадочную жидкость (плазму крови) тщательно отсасывают пастеровской пипеткой в отдельную сухую (лучше мерную) пробирку и доливают равный объем физиологического раствора. Получают плазму крови, разведенную в 2 раза. Затем в агглютинационную пробирку наливают 0,2 мл 0,025 М раствора CaCl2 и 0,1 мл суспензии тромбопластина, помещают ее в водяную баню при температуре 38° и включают секундомер.

Через 60 секунд в агглютинационную пробирку быстро вводят микропипеткой 0,1 мл разведенной плазмы и одновременно включают секундомер. Время от времени встряхивая пробирку, наблюдают за появлением зернышек или нитей фибрина и в момент его появления включают секундомер, а пробирку вынимают из водяной бани.

Таким же образом проводят еще одно или два параллельных определения. При этом разница во времени между параллельными определениями должна составлять не более 0.5-1 секунды.

Определение активности протромбина следует проводить не позже чем через 2 часа после взятия крови.
Закончив определение, рассчитывают протромбиновый индекс, используя для этого среднее арифметическое из параллельных определений по формуле:

Протромбиновый индекс = (протромбиновое время здорового)/(протромбиновое время исследуемого)х100.

Протромбиновое время здорового человека указано на этикетке флакона с тромбопластином. Дополнительно протромбиновое время, указанное на этикетке, проверяют на здоровых людях (1-2 человека). Время (по секундомеру), прошедшее с момента добавления плазмы до появления сгустка, является протромбиновым временем обследованного человека.

Протромбиновый индекс в норме при определении его по данной методике равен 80-100 %.

Результаты определений оформляют в бланке анализа.