Различные молекулярно-биологические технологии
В данной статье рассмотрены реакции транскрипционно опосредованной амплификации, ДНК-РНК гибридный захват и метод гибридизации с использованием разветвленных зондов (ГДНК, branched DNA-test).
Реакции транскрипционно опосредованной амплификации
Наиболее распространенная технология — амплификация, основанная на чередовании последовательности нуклеиновых кислот (англ. – Nucleic Acid Sequence-Based Amplification NAS BA). Это праймер- опосредованная ферментативная реакция in vitro для поточной и изотермальной амплификации специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Метод используют в основном для репликации РНК. При реверсивной транскрипции сДНК образуется из искомой РНК. Важно, что праймер для этого этапа имеет дополнительный РНК-промотер — последовательность, прикрепляющуюся к его концу. Второй фермент РНКаза Н, присутствует в реакционной смеси и немедленно расщепляет искомую РНК внутри этой двойной цепи. Параллельно первый фермент (реверсивная транскриптаза, обладающая также полимеразной активностью) начинает полимеризовать комплементарную ДНК с праймера 2. Эта двухцепочечная сДНК теперь имеет функциональную последовательность РНК-промотера, с которой третий фермент в реакционной смеси (РНК-полимераза) может синтезировать несколько новых копий РНК. Эти копии немедленно конвертируются в копии сДНК и, соответственно, в двойные цепи ДНК, которые снова служат стартовым материалом для новых РНК цепей. Таким образом, в течение 40-50 мин в растворе образуется 10^8-10^9 РНК.
ДНК/РНК-гибридный захват
Данная методика относится к технологиям амплификации сигнала (рис. 5.5). Принцип основан на иммунохимической детекции продуктов гибридизации нуклеиновых кислот РНК/ДНК или ДНК/РНК с помощью моноклональных антител, распознающих образующиеся дуплексы (двойные цепи) нуклеиновых кислот. Для обнаружения бактерий или ДНК-содержащих вирусов применяют РНК-зонд. В случае выявления РНК-содержащих инфекционных агентов (вирус гепатита С) используют ДНК-зонд. Обнаружение и определение в этих случаях основано на хемилюминесцентной детекции результатов гибридизации. Здесь сведены к минимуму процессы подготовки биожидкости для исследования и очистки нуклеиновых кислот, что позволяет использовать иммунохимическую детекцию РНК/ДНК-гибрида для скрининга.
Рис. 5.5. Схема ДНК-РНК гибридного захвата
Метод гибридизации с использованием разветвленных зондов (ГДНК, branched DNA-test)
Это – метод амплификации сигнала в ходе определения, независимый от праймеров, основан на связывании синтетических, разветвленных молекул ДНК с искомой нуклеиновой кислотой. В результате многоступенчатого процесса гибридизации происходит присоединение многочисленных зондов, конъюгированных с молекулами фермента, окисляющего люминогенный субстрат и запускающего таким образом хемилюминесценцию.
Эти методы очень надежны, чувствительны и хорошо подходят для количественной оценки содержания нуклеиновых кислот в биожидкостях. Однако на некоторых этапах они трудоемки и их применение в клинико-диагностических лабораториях зависит от доступности коммерческих тест-систем.
