Автоматизация методов исследования свертывающей и противосвертывающей систем крови
В этих приборах используются все виды аналитических технологий, известных в коагулологии: клоттинговые, хромогенные и иммунохимические.
Клоттинговые технологии основаны на образовании в ходе исследования аналита сгустка фибрина и регистрации механическими, оптическими или оптико-механическими методами начала или окончания времени его образования. Так определяется активность исследуемого фактора свертывающей или противосвертывающей систем в каскаде процесса образования сгустка или его лизиса.
Методы с использованием хромогенных субстратов основаны на способности факторов свертывания проявлять ферментативные свойства сериновых протеаз. Такими свойствами обладает тромбин, образующийся в ходе реакций определения протромбинового времени, протеин С и др. В ходе анализа образующийся тромбин (или другая сериновая протеаза) вызывает гидролиз хромогенного субстрата в месте присоединения к полипептидной цепи окрашенного соединения, например, 4-нитроанилина. В результате не имеющий окраски субстрат (тосилглицилпролиларгинил-4-нитроанилид) отдает в реакционную смесь отсоединившийся от него 4-нитроанилин и раствор приобретает зеленовато-желтый цвет, светопоглощение которого измеряется фотометрически – кинетически или путем измерения фиксированной абсорбции. Учитывая, что при этом параллельно вследствие образования тромбина (например, при определении протромбинового времени с хромогенными субстратами) фибриноген превращается в фибрин, вызывающий помутнение раствора, при специальном программировании коагулологических анализаторов в рамках определения одного показателя, в данном случае протромбинового времени, можно определять и концентрацию фибриногена.
Иммунохимические методы на основе реакции преципитации комплекса «антиген-антитело» с использованием антител (например, в случае Д-димера), иммобилизованных на латексных частицах или путем иммуноферментного анализа позволяют определять факторы свертывающей и противосвертывающей систем так, как определяют различные белки, антигены. В первом случае для детекции используют лазерную нефелометрию, во втором – фотометры и фотометрические ридеры для иммуноферментного анализа.
Соответственно в конструкции автоматических коагулологических анализаторов должны быть представлены устройства или блоки для реализации этих технологий: устройства для вращения шариков в тестовых пробирках и детекторы, регистрирующие время прекращения этого вращения в результате образования сгустка крови; дозаторы для добавления хромогенных реагентов и фотометрические детекторы; комплекс устройств для иммунохимического исследования. Примером такого прибора может служить «STA Compact» (Швейцария), способный реализовать до 80 программируемых тестов системы свертывания, включая протромбиновое время, факторы внешнего пути активации (II, V, VII, X), факторы внутреннего пути активации (VIII, IX, XI, XII), фибриноген и др. Производительность прибора – до 150 тестов в час, может быть выполнено до 12 методов на одну пробу. До 1000 анализов выполняются в режиме walk away, т. е. без присутствия оператора после запуска прибора в работу.
Механический способ детекции образования сгустка путем регистрации изменения (снижения вследствие повышения вязкости пробы) амплитуды колебаний стального шарика, находящегося в магнитном поле, в кювете на полукруглом ее дне обеспечивает независимость результатов от окраски и оптических свойств пробы плазмы, в частности до концентрации гемоглобина в ней 20 г/л.
Сосуды с реактивами охлаждаются в штативе для них и прогреваются в специальных позициях до требуемой температуры 37 °С. Кюветы для выполнения и измерения продукта реакции загружают в рулонах по 1000 шт. по аналогии заправки фотопленки в фотоаппарат, а по окончании использования их сбрасывают в опечатанный контейнер для обеспечения максимума безопасности и исключения контакта с оператором. Свыше 14000 результатов может храниться в памяти прибора. Имеются встроенные программы контроля качества с представлением статистических данных за любой период времени (день, месяц, год).
В семействе коагулологических анализаторов «Thrombolyser Compact», «Thrombolyser Rack Rotor», «Thrombolyser Combi» (Германия) применяется единая технология с использованием общей кюветы, куда дозируются проба и реагенты и где они одновременно инкубируются, не смешиваясь, после чего при помещении в измерительный блок и перевороте кюветы на 90° происходит их смешивание до гомогенной смеси с помощью стального шарика (рис. 10.1). Связывание шарика с нитями фибрина позволяет точно документировать время образования сгустка. Описанные анализаторы относятся к автоматам дискретного типа.
Рис. 10.1 Схема исследования в автоматическом коагулологическом анализаторе «Trombolyzer Combi»: а — пипетирование; 6 — перевертывание кюветы; в — измерение
С помощью центрифужных анализаторов семейства «ACL 100-7000» (США) автоматизированные коагулалогические исследования выполняют в секторах роторов. Каждый из секторов заканчивается измерительной кюветой. В случае измерения мутности используется нефелометрический способ измерения рассеяния света луча лазера частицами под углом 90° к направлению падающего света. Другой принцип измерения в этих анализаторах — фотометрический – для методов с хромогенными субстратами.
Автоанализаторы для наиболее трудно автоматизируемых коагулологических исследований – агрегации тромбоцитов (анализаторы «Trombostat 4000» и их последующие варианты – «PFA-ЮО», США) позволяют не только выявлять дефекты функции тромбоцитов, но и отслеживать эффекты лечения, например, ацетилсалициловой кислотой. Кроме того, на них в течение 10 мин определяется и время кровотечения.
Эти приборы контролируются микропроцессорами. Реакция для каждого теста проходит в специальном картридже, компонентами которого являются чашка с так называемой капиллярной ассамблеей, которая вставляется в специальный кожух – резервуар для пробы. Цельная кровь с антикоагулянтом (цитрат) пипетируется в отверстие для ввода пробы.
После инкубации чашка, соединенная с капилляром, передвигается вниз внутрь кожуха, капилляр из нержавеющей стали пробивает мембрану, покрывающую пробу. Кровь движется вверх по капилляру и приходит в контакт с мембраной, покрытой коллагеном, адреналином, барбитуратами или АДФ. Эти вещества стимулируют тромбоциты к прилипанию и агрегации на мембране.
Таким образом, путем автоматизации коагулологических исследований, появляется возможность не только упростить технологию (как, например, в случае определения фибриногена в плазме) по сравнению с ручным методом, не только ускорить выполнение анализа и увеличить производительность труда, но и стандартизовать методы, значительно улучшить качество, повысить надежность результатов.
