Лептоспирозы

Лептоспирозы инфекционные болезни людей, диких млекопитающих, сельскохозяйственных, домашних, промысловых животных, водоплавающих птиц. Вызываются микроорганизмами, которые объединяются родовым названием Leptospira и принадлежат к семейству Treponemataceae.

Лептоспирозы составляют группу заболеваний, сходных по патогенезу, клинике и эпидемиологии. Они относятся к числу глобальных природноочаговых инфекций; для них не характерна приуроченность к определенной природной зоне. В Советском Союзе заболевания людей лептоспирозной этиологии диагностированы в различных климатических поясах: от арктического до субтропического, а в долготном направлении – от западных границ страны до Приморья на Дальнем Востоке.

Этиология

Согласно решению Международного подкомитета по таксономии лептоспир и научной группы ВОЗ (1966), род Leptospira представден двумя видами – L. icterrogans и L. biflexa, объединяющими паразитические и свободноживущие формы, которые в свою очередь состоят из многочисленных серологических типов. На основании антигенного средства серотипы формируют серологические группы. В Международной классификации представлено 124 серотипа, объединенных в 18 серологических групп.

Научная группа ВОЗ предложила считать два штамма принадлежащими к разным серотипам, если после перекрестной адсорбции гетерологичным антигеном в повторных опытах в каждой из двух антисывороток обнаруживается не менее 10% остаточных антител к гомологичным штаммам.

В СССР от людей и животных выделены культуры лептоспир, относящихся к 13 серогруппам; они объединяют 26 серологических типов, из которых 15 вызывают заболевания людей.

Наиболее широко распространены представители серогрупп, гриппотифоза, гебдомадис, вызывающие групповые заболевания среди людей и эпизоотии сельскохозяйственных, промысловых животных и мелких млекопитающих. Заболевания, вызванные лептоспирами иктерогеморрагическими, каникола Тарасова и др., имеют в обычных условиях спорадический характер.

Лептоспиры – нежные микроорганизмы спиралевидной формы, длиной 6-20 мкм и диаметром 0,2 мкм. Концы лептоспир, как правило, загнуты в виде крючков. Встречаются и бескрючковые формы этих микроорганизмов. Размножаются лептоспиры путем поперечного деления. В жидкой среде они обладают весьма активной подвижностью, с которой связана их высокая инвазионная способность. Формы движения весьма разнообразны: прямолинейное, ротационное, сгибательное. Лептоспиры с трудом воспринимают окраску; они слабо преломляют свет, поэтому микроскопию нативных препаратов (из различного инфекционного материала и живые культуры) проводят в темном поле; при этом микроорганизмы имеют вид серебристых нитей с типичной морфологией и характерными движениями.

Лептоспиры чувствительны к воздействию высоких температур: кипячение их убивает мгновенно, нагревание до 56-60° – в течение 20-25 минут. Напротив, к низким температурам эти микроорганизмы проявляют устойчивость: они переносят неоднократное замораживание, сохраняя жизнеспособность и вирулентность в течение многих месяцев в условиях длительного хранения их в жидкой среде при минус 30–70°. Лептоспиры погибают под действием прямых солнечных и ультрафиолетовых лучей, а также кислот и щелочей даже в минимальных концентрациях (0,1-1%). Срок переживания лептоспир в пищевых продуктах значительно варьирует в зависимости от pH, температуры их хранения и обсемененности посторонней микрофлорой. В мясе убойного скота, например, при температуре 6° и pH не выше 6,2 лептоспиры могут сохраняться в течение двух суток. Желчь, желудочный сок, кислая моча человека и плотоядных губительно действует на лептоспиры; в слабощелочной моче травоядных животных они остаются жизнеспособными несколько суток.

Важными условиями для выживания лептоспир во внешней среде являются повышенная влажность и pH в пределах 7,0-7,4. В воде патогенные лептоспиры сохраняются в течение месяца, а в сырой и переувлажненной почве – 279 дней (pH 7,2) (Е. В. Карасева и С. В. Зайцев, 1973). Установлена зависимость территориального распространения лептоспирозов людей и сельскохозяйственных животных и показателей их заболеваемости от физико-химического состава почв. В районах с преобладанием
кислых почв заболеваемость ниже, чем на участках с карбонатными почвами.

Патогенетические и клинические черты

Лептоспиры проникают в организм человека через слизистые оболочки рта, глаз, носа и поврежденную кожу. Оральный способ инфицирования наиболее част. Инкубационный период обычно составляет 7-10 дней. В инфекционном процессе различают 2 фазы: лептослиремию и токсемию. Первая соответствует недельному сроку от начала заболевания; в течение этого периода происходит интенсивное размножение возбудителя в крови и концентрация его в печени. Для этой фазы характерны симптомы общей реакции организма на продукты распада лептоспир. Фаза токсемии совпадает со второй неделей заболевания, когда лептоспиры накапливаются в извитых канальцах почек и выделяются с мочой, вызывая длительную лептоспирурию. Возбудитель может быть также обнаружен в спинномозговой жидкости. В этот период отмечается выраженное поражение печени под влиянием токсических продуктов лептоспир. Вследствие доброкачественного в подавляющем большинстве случаев течения лептоспирозов у людей патоморфологическая картина основана на изучении секционного материала, полученного при наиболее тяжело протекавших, иктерогеморрагическом и каникола, лептоспирозах. В этих случаях на вскрытии отмечали желтуху, проявление геморрагического диатеза и дистрофические изменения паренхиматозных органов. При гистологическом исследовании органов людей и животных лептоспиры в наибольшем количестве определяются в печени и почках. Значительное сходство внешних проявлений, патоморфологических и патогенетических черт позволяет рассматривать лептоспирозы как клинически единую болезнь, вызываемую лептоспирами различных серотипов.

Клиническое проявление лептоспирозов в значительной степени связано с интоксикацией. Характерно острое, внезапное начало, сопровождающееся ознобом, высокой температурой, сильной головной болью, мышечными и суставными болями; отмечается общая слабость, адинамия, гиперемия лица, инъекция склер, диспептические явления; печень, как правило, увеличена, болезненна. Нарушение углеводной, белковой, пигментной и антитоксической функций печени определяется не только при желтушном, но и безжелтушном течении лептоспирозов. Поражение почек постоянно – с первых дней заболевания оно проявляется в виде острого очагового нефроза. В моче наблюдается повышенное содержание белка, эритроциты, гиалиновые и зернистые цилиндры. При тяжелом течении могут возникать явления острой почечной недостаточности. В осложненных случаях нередко диагностируют менингеальные симптомы с ранним обнаружением патологических сдвигов в спинномозговой жидкости выделением из нее лептоспир и обнаружением антител.

Длительность первой температурной волны 5-7 дней. Рецидивы лихорадки имеют место (в 20% и чаще) обычно после нескольких дней апирексии. Вторая лихорадочная волна обусловлена повторным поступлением лептоспир в кровь. Общая продолжительность лихорадочного периода не превышает, как правило, двух недель. Желтушность кожи, склер и полиморфная сыпь появляются на 4-6 дни заболевания. Желтуха может наблюдаться при всех этиологических формах лептоспирозов. Геморрагический синдром проявляется в виде кровоизлияний на коже и слизистых оболочках и различных кровотечений (носовых, маточных, кишечных), нередко неоднократных и обильных. Интенсивность желтухи и геморрагического комплекса имеет прогностическое значение. Желтуха и геморрагические явления с наибольшим постоянством наблюдаются при иктеро-геморрагическом и каникола лептоспирозах, приводя в ряде случаев к летальным исходам. При тяжелом течении лептоспирозной инфекции следует применять в ранние сроки болезни этиотропную терапию – поливалентный лептоспирозный гамма-глобулин.

Перенесение лептоспирозной инфекции приводит к формированию типоспецифического иммунитета, предохраняющего от повторного заболевания. Ведущее значение в невосприимчивости принадлежит гуморальным факторам. У людей и животных на первой неделе заболевания образуются агглютинины, лизины, комплементсвязывающие антитела; они могут длительно (на протяжении месяцев, а иногда и лет) сохраняться в крови. Установлено, что в процессе иммуногенеза репродуцируются антитела, принадлежащие к иммуноглобулинам различных классов. Изучение динамики этих антител на разных этапах инфекционного процесса, по-видимому, может иметь значение для разграничения острой формы лептоспироза от иммунологического следа перенесенного заболевания (Е. М. Попова, Н. А. Стоянова, 1973). Несмотря на наличие в крови реконвалесцентов высоких титров антител, у них происходит выделение лептоспир с мочой, что позволяет предположить существование фазы нестерильного (инфекционного) иммунитета. В энзоотических очагах наиболее тяжелое течение заболеваний наблюдается обычно среди недавно прибывших сюда людей. Это допускает предположение о существовании в этих условиях феномена «проэпидемичивания» малыми дозами возбудителя и создания таким путем относительной невосприимчивости; в пользу «немого» инфицирования свидетельствует и обнаружение специфических антител в крови здоровых людей, длительно работающих на неблагополучных по лептоспирозу предприятиях, например, на мясокомбинатах.

Подобная же иммунизация, по-видимому, имеет место и среди животных и этим можно объяснить причину заболевания только части поголовья в пораженных хозяйствах, в то время как у большинства здоровых особей в крови обнаруживают специфик веские антитела. Они могут передаваться потомству через плаценту, а также с материнским молоком.

Эпидемиологическая характеристика

Основными источниками лептоспирозной инфекции для людей являются дикие мелкие млекопитающие (главным образом, грызуны), больные и переболевшие сельскохозяйственные животные. Нельзя исключить возможную роль некоторых видов птиц. Они участвуют в формировании и поддержании природных, антропургических и смешанных лептоспирозных очагов. Носительство лептоспир, доказанное выделением культур, установлено у 98 видов млекопитающих, шести видов птиц (Е. В. Карасева, 1967).
Природные очаги лептоспирозов имеют определенную ландшафтную приуроченность. Основными источниками возбудителей являются различные виды влаголюбивых грызунов рода Microtus, обитающие в увлажненных биотопах. Роль отдельных видов далеко неравнозначна в связи с различной степенью чувствительности их к лептоспирам. Виды, у которых в результате инфицирования возникает хронический, нередко бессимптомно протекающий процесс, сопровождающийся длительным выделением микроорганизмов с мочой, имеет наибольшее эпидемиологическое и эпизоотолбгическое значение; они обеспечивают сохранение лептоспир в природе. Менее чувствительные виды, у которых заражение вызывает лишь кратковременную лептоспироурию среди небольшого числа особей, не играют самостоятельной роли и могут вовлекаться в эпизоотический процесс только при его высокой напряженности. Широко проводимые агротехнические и мелиоративные мероприятия в значительной степени ограничивают активность природных очагов и их эпидемическую проявляемость. Однако в процессе широкого хозяйственного освоения новых территорий значение природных очагов может и возрастать (проведение ирригационных работ, рисосеяние и т. д.).

Биологическая пластичность лептоспир обусловливает возможность адаптации их к сельскохозяйственным животным (крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, лошади),промысловым зверям (лисицы, песцы, нутрии), домашним и одомашненным животным (собаки, олени). Сельскохозяйственные и одомашненные животные чаще всего инфицируются в местах водопоя, купания или выпаса в переувлажненных угодьях, населенных зараженными грызунами. Лептоспирозные заболевания зверей, содержащихся в питомниках, связаны с кормлением их мясом больных животных. Являясь источником инфекции, они участвуют в формировании хозяйственных очагов лептоспирозов имеющих в настоящее время самостоятельное, ведущее эпидемиологическое значение.

В противоположность грызунам, у которых лептоспироз протекает в виде бессимптомной инфекции, у сельскохозяйственных, промысловых и домашних животных, наряду с этой формой течения, нередко возникают выраженные заболевания, характеризующиеся лихорадкой, желтухой, выделением кровавой мочи («иктерогемоглобинурия крупного рогатого скота и лошадей»). У крупного рогатого скота различают острое течение болезни, заканчивающееся гибелью животных, а также подострые и хронические формы.

Значительна эпидемиологическая роль свиней в связи с крайне разнообразными клиническими проявлениями заболеваний среди молодняка, затрудняющими диагностику, а также бессимптомным течением лептоспирозной инфекции у взрослых животных, сопровождающимся длительным выделением лептоспир. В настоящее время уровень заболеваемости населения лептоспирозами зависит от распространения его среди крупного рогатого скота и свиней.

Антропоургические очаги не связаны с ландшафтами, они могут возникать как в сельских местностях (в животноводческих хозяйствах), так и в городских условиях (на предприятиях, перерабатывающих животное сырье). Определенную роль в поддержании этих очагов играют также синантропные грызуны и собаки. Эпидемическое и эпизоотическое неблагополучие в таких очагах обусловлено нарушением санитарно-ветеринарного режима. Смешанные очаги формируют представители дикой фауны и сельскохозяйственные животные.

Этиологическая структура лептоспирозной инфекции в природных очагах зависит от соотношения видов биологических хозяев лептоспир, обитающих в определенных ландшафтно-географических районах. Так, доминирование в фауне серых полевок обусловливает распространение лептоспир гриппотифоза, полевые мыши являются основным носителем лептоспир помона, бурозубки.

«Пейзаж» патогенных лептоспир, циркулирующих в антро-пургических очагах, определяется преобладающими видами сельскохозяйственных животных: в свиноводческих хозяйствах ведущие возбудители – помона и Тарасова, среди крупного рогатого скота доминируют лептоспиры гриппотифоза и представители серогруппы гебдомадис. В очагах, поддерживаемых серыми крысами, основное значение имеют иктерогеморрагические лептоспиры. Ведущим фактором передачи возбудителей лептоспирозовявляется вода, загрязненная мочой инфицированных животных. Заряжение людей связано с купанием и употреблением для питья и хозяйственных целей сырой воды из небольших непроточных водоемов, в которых патогенные лептоспиры сохраняют жизнеспособность в течение месячного срока. В очагах инфекции из водоемов были выделены культуры лептоспир: иктерогеморрагических, гриппотифоза, каникола, помона и других. В передаче лептоспир также имеют значение пищевые продукты, загрязненные выделениями инфицированных грызунов или происходящие от больных сельскохозяйственных животных (молоко, мясо).

Естественная восприимчивость людей к возбудителям лептоспирозов значительна. Подростки и взрослые болеют чаще, чем дошкольники. Возрастной состав больных обусловлен особенностями (типом) вспышек. Заболевание детей связано с купанием; заражения профессионального характера наблюдаются, главным образом, среди лиц молодого и среднего возраста. Иммунная прослойка населения в эндемичных очагах увеличивается с возрастом.

Спорадические заболевания лептоспирозами могут возникать на протяжении всего года, а эпидемические вспышки приурочены, как правило, к летне-осеннему периоду. Это связано с увеличением численности мышевидных грызунов, метеорологическими условиями, наиболее благоприятствующими сохранению лептоспир во внешней среде в это время, пребыванием сельскохозяйственных животных на пастбищах, увеличением контакта людей с источниками и факторами передачи инфекции, в частности во время уборочных полевых работ.

Основные типы вспышек: а) водный тип (заболевания возникают в результате купания в водоемах, инфицированных сельскохозяйственными животными или мелкими млекопитающими, и употребления воды из них для хозяйственных и бытовых целей); б) сельскохозяйственный тип (заболевания связаны с сенокошением, рисосеянием, а также мелиоративными и ирригационными работами); в) животноводческий тип (заболевания связаны с уходом за больными животными, убоем и обработкой их сырья).

По профессиональному признаку наиболее угрожаемыми в отношении лептоспирозов группами населения надо считать сельскохозяйственных рабочих в период уборки урожая (при сенокошении на заболоченных и увлажненных лугах в поймах рек, на рисовых плантациях и т. д.). Определенному риску заражения подвергаются также скотоводы, рабочие боен и мясокомбинатов, а также персонал звероферм и питомников. В зависимости от причин, обусловивших заражение, профессиональные заболевания могут быть схематически подразделены на пять типов: сельскохозяйственный, промысловый, производственный экспедиционный, лабораторный (К. Н. Токаревич, 1969). Наибольшее эпидемиологическое значение имеют первый и третий из них.

Профилактика лептоспирозов требует осуществления комплекса организационных, медико-санитарных, зоогигиенических и ветеринарных мероприятий. Они должны быть направлены на предотвращение контакта людей с источниками инфекции (дикими и сельскохозяйственными животными) и зараженной их выделениями внешней средой, а также создание невосприимчивости определенных групп населения путем вакцинации.

Наиболее важными мерами в плане оздоровления природных и хозяйственных очагов являются защита источников водоснабжения от загрязнения их животными-лептоспировыделителями, своевременное выявление эпизоотий среди скота, изоляция больных животных, усиление карантинных мероприятий, вакцинация поголовья. Для предупреждения различных эпизоотий в природных очагах рекомендуется проведение грызуноистребительных работ, особенно в границах «элементарных очагов» — станциях переживания зверьков-лептоспироносителей.

Лабораторные методы исследования

Диагноз лептоспирозной инфекции должен быть основан на данных клиники, эпидемиологического обследования и результатах лабораторных исследований. Решающим доказательством является положительное заключение лаборатории. Для подтверждения лептоспирозной инфекции у людей, сельскохозяйственных, домашних, промысловых и диких животных, а также проведения дифференциального диагноза в отношении некоторых инфекционных и других заболеваний, протекающих при сходной с лептоспирозами клинике, применяют различные микробиологические методы: микроскопический, бактериологический, биологический и серологический.

Материалами для исследования служат кровь, ликвор, моча, внутренние органы и тканевые жидкости (околосердечная, грудной и брюшной экссудаты).

Для выделения культур лептоспир из крови посев и заражение животных следует проводить в течение первой недели заболевания, в период бактеремии, из ликвора – на второй неделе. Оптимальные сроки исследования мочи – с конца второй по четвертую неделю. Выявление специфических антител в крови показано с 5-7 дня при обязательном проведении повторных исследований в более поздние сроки.

Наиболее доказательным является выделение культур возбудителей и выявление специфических антител в крови. Для обнаружения лептоспир в органах погибших людей и животных помимо вышеуказанных способов пользуются гистологическим методом – импрегнацией срезов серебром по Левадити.

Метод прямой микроскопии

Микроскопируют нитратную кровь (1 мл крови смешивают с 2 мл 1,5% раствора лимоннокислого натрия, после центрифугирования ее или отстаивания просматривают плазму), спинномозговую жидкость, мочу (нативную и осадок), надосадочный слой суспендированных в физиологическом растворе паренхиматозных органов. Можно также производить забор ткани печени, коркового слоя почек (в котором локализуются лептоспиры) пастеровской пипеткой с последующим эмульгированием их в физиологическом растворе на предметном стекле. Исследованию также подлежит околосердечная жидкость, грудной и брюшной экссудат погибших животных.

Из инфекционного материала готовят препарат «раздавленная капля» (по 3 капли на стекле), для чего используют чистые обезжиренные предметные стекла, толщиной 0,8-1,0 мм. Микроскопию производят с применением темнопольного конденсора (ОИ-13) при помощи сухих систем (объектив Х20-7, Х40; окуляр Х7 – Х10) и осветителя (ОИ-19). Предварительно на линзу конденсора наносят каплю дистиллированной воды. Просматривают до 10 препаратов.

Во избежание возможных диагностических ошибок при микроскопировании крови и мочи необходимо дифференцировать лептоспир от других извитых подвижных организмов – интерспир, а также нитей фибрина, руководствуясь при этом типичной морфологией лептоспир и их характерным поступательным движением.

Прямая микроскопия является ценным способом быстрой диагностики лептоспирозов, но имеет ориентировочное значение – отрицательные результаты его не исключают лептоспирозную природу заболеваний.

Бактериологический метод

Для выделения лептоспир от больных людей и животных и для поддержания выделенных культур применяют преимущественно жидкие среды. Наиболее простыми по составу, обеспечивающими хороший рост лептоспир являются водносывороточная среда Уленгута и фосфатно-сывороточная – Терских, в состав которых входит нативная или инактивированная при 56° кроличья сыворотка (5-10%) и буферная смесь Зеренсена (pH 7,2-7,4), которую готовят из М/15 раствора Na2HP04-2H20 и М/15 раствора КН2Р04. Фосфатный буфер добавляют в количестве 10% к объему воды. В некоторые среды в качестве питательных веществ добавляется пептон, агар, 10% гидролизат дрожжей, гемолизин и т. д.

В ветеринарной практике широко применяют полусинтетическую бессывороточную среду, в состав которой входит альбуминовая фракция сыворотки крови овец и фактор роста – нативный экстракт печени овец с включением витаминов, микроэлементов и биоактиваторов (М. А. Бабич и соавт., 1965). Посевы асептично взятых крови, ликвора, мочи, органов животных и их абортированных плодов в количестве 5-20 капель производят в 3-5 пробирок с 5 мл питательной среды. Для получения гемокультуры помимо цитратной крови можно засевать нативную кровь непосредственно у постели больного в стерильную воду.

Бактериологическое исследование трупов животных, в том числе и экспериментальных, надо проводить в течение 12 часов после их гибели. Можно производить посевы и замороженных органов, так как лептоспиры остаются в них жизнеспособными в течение недельного срока.

Оптимальная температура выращивания лептоспир 28-30°. В связи с медленным ростом первичные посевы обычно сохраняют в термостате в течение 1-3 месяцев и в течение этого срока проводят периодически (через 5-7 дней) их микроскопию в темном поле. Лептоспиры в процессе размножения не изменяют питательной среды, она остается прозрачной и бесцветной, только при пышном росте наблюдается в проходящем свете ее легкое помутнение.

Для поддержания в лабораторных условиях свежевыделенных штаммов и диагностических культур, лептоспир необходимы пересевы их 1-2 раза в месяц на ряд пробирок (посевная доза 2-0,5 мл). В целях длительного сохранения живых культур предложен метод их замораживания при температуре минус 30-70°.
Определение серогрупповой принадлежности выделенных культур проводят в реакции микроагглютинации с типоспецифическими лептоспирозными сухими сыворотками, выпускаемыми Ставропольским НИИВС. В целях серотиповой идентификации применяют метод перекрестной иммуноадсорбции, предложенный (Wolf, 1954).

Техника этого метода описана В. В. Ананьиным и Ю. Г. Чернухой (1973).

Длительность выделения лептоспир из первичного инфекционного материала в известной степени снижает ценность бактериологического исследования как метода ранней диагностики, поэтому оно обязательно должно проводиться в комплексе с серологическими реакциями.

Биологический метод

Воспроизведение экспериментальной лептоспирозной инфекции преследует не только диагностические цели (выделение культуры возбудителя), но и изучение биологических свойств лептоспир, патогенеза и др.
В качестве подопытных животных применяют морских свинок (100-200 г), являющихся наилучшей моделью иктерогеморрагического лептоспироза (к лептоспирам других групп они относительно резистентны), а также крольчат и золотистых хомяков двух-трехнедельного возраста, высокочувствительных к различным серотипам лептоспир. Материалом для заражения служит кровь, моча, спинномозговая жидкость, взвеси органов, которые вводятся внутрибрюшинно или подкожно (в объеме 0,5-2,5 мл, в зависимости от веса животных). Инфицированных животных ежедневно термометрируют и периодически взвешивают. В положительных случаях они реагируют повышением температуры до 40-41° (в этот период пунктируют сердце и проводят посев крови), падением веса, появлением желтухи кожных покровов и видимых слизистых. При явлении гипотермии наступает гибель. На вскрытии отмечается желтуха, кровоизлияния в подкожной клетчатке и внутренних органах, наиболее выраженные в легких и в области подмышечных и паховых лимфоузлов. Для выделения возбудителя проводят посев крови, органов, мочи, грудного и брюшного экссудатов. У выживших животных наблюдается длительная лептоспирурия и наличие антител в крови. Путем серебрения гистологических препаратов по Левадити лептоспиры могут быть обнаружены в печени, почках и других органах.

К биологическим пробам на морских свинках прибегают также для выделения патогенных лептоспир из водоемов и почвы (см. ниже).

Серологические методы

Ведущее место в лабораторной диагностике лептоспирозов занимает серологический метод исследования, осуществляемый, главным образом, при помощи реакции микроагглютинации (РМА) с живыми культурами лептоспир. Этот тест обладает высокой специфичностью. Его применяют для целей острой и ретроспективной диагностики лептоспирозов, для выявления стертых и бессимптомных форм заболеваний в эпидемических очагах. Специфические антитела обнаруживаются в крови больных людей с конца первой недели заболевания, достигают наивысшей концентрации к периоду выздоровления на третьей-четвертой неделях.

Реакцию микроагглютинации ставят объемным или капельным методами. В первом случае в узких пробирках смешиваются в равных объемах (по 0,2 мл) разведения сыворотки и культуры лептоспир. Чаще применяют капельную модификацию в полистироловых пластинах с лунками. Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты:

• испытуемая сыворотка человека и животных: свежая, консервированная 5% фенолом (1 капля раствора на 1 мл сыворотки) или борной кислотой, а также высушенная на фильтровальной бумаге (в объеме 0,1 мл); сухие капли сыворотки или крови пригодны для исследования в течение 1-3 месяцев;
• стерильный физиологический раствор (0,85%);
• антиген – 7-10-дневные живые культуры лептоспиры содержащие до 100 особей в поле зрения, обладающие типичной морфологией, хорошей подвижностью, отсутствием явлений лизиса и агглютинации.

Для постановки РМА пользуются предложенным справочной лабораторией ВОЗ (В. В. Ананьин и Ю. Г. Чернуха, 1973) диагностическим набором штаммов лептоспир 14-ти серогрупп, обладающих широким спектром внутригрупповых антигенных связей, что обеспечивает серогрупповой диагноз (табл.). Помимо международных эталонов, в него включены аналоги — культуры отечественного происхождения.

Диагностические культуры можно получить в лаборатории лептоспирозов ИЭМ им. Гамалеи (Москва). Сыворотку больного человека или животного испытывают со всеми культурами диагностического ряда, рекомендуется также введение в опыт местных штаммов лептоспир, с которыми РМА дает более высокие титры.

Для постановки РМА к основным разведениям испытуемых сывороток, кратным двум (1:25, 1:50, 1:100), прибавляется равное количество культуры (при этом разведения удваиваются). При исследовании сухой сыворотки или крови фильтровальную бумагу с нанесенной каплей (0,1 мл) измельчают, заливают 10-кратным объемом физиологического раствора и экстрагируют 1 час при 37°. Из основного разведения готовят последующие. Реакция микроагглютинации может быть также применена для определения антител в спинномозговой жидкости (при лептоспирозных менингитах) и в моче, в положительных случаях титры реакции низкие, они не превышают 1:32.При проведении серологического исследования сначала ставится ориентировочная реакция в двух разведениях (например, 1:25 – 1:100 или 1:100 – 1:400) для исключения феномена «прозоны»; в случае положительного ответа проводят раститровку сыворотки.

Смесь культур с сыворотками выдерживают в термостате при 37° в течение 1-2 часов. Контролем опыта служат равные объемы культур (ОД – 0,2 мл) с физиологическим раствором. Учет реакции производят в темном поле микроскопа в препаратах «раздавленная капля». Можно также нанести на предметное стекло бактериологической петлей 20-30 капель содержимого пробирок или лунок и рассматривать их без покровных стекол (объектив х20, окуляр х10). При положительной реакции под влиянием специфических иммунных тел происходят резкие изменения лептоспир. В низких разведениях сыворотки обычно
проявляется феномен лизиса, сопровождающийся потерей микроорганизмами подвижности, зернистым распадом их с последующим образованием различных форм агглютинатов в виде «паучков», «клубочков», «кос». Оценка результатов реакции и ее интенсивности производится по четырехбалльной шкале в крестах (схематически учет реакции воспроизведен на рис. 1):

A) агглютинация 100% лептоспир – резкоположительная (+ + + + );

Б) агглютинация 75% лептоспир – положительная (+ + + );

B) агглютинация 50% микроорганизмов – слабоположительная (+ + );

Г) агглютинация отсутствует – отрицательная реакция. Концентрация лептоспир соответствует контролю.

Рис. 1. Реакция микроагглютинации лептоспир (схема)

Титром сыворотки считают наивысшее ее разведение, в котором реакция выражена двумя крестами.

Минимальным диагностическим титром при острых формах лептоспирозной инфекции является разведение 1:100 при повышении его в динамике инфекционного процесса. Некоторые исследователи (И. Л. Коковин и соавт., 1973) рекомендуют для выявления «ранних» антител производить исследование сывороток с 3-5 дня болезни и считают убедительным диагностический титр 1:20, если при первичном исследовании сыворотки был получен отрицательный результат.

При наличии в испытуемых сыворотках межгрупповых реакций, возбудителями болезни считают лептоспир той серологической группы, с которыми получены наивысшие титры. Положительный ответ с несколькими культурами, не дающими между собой перекрестных реакций, может расцениваться как результат смешанной инфекции.

В связи с длительным сохранением специфических антител в крови переболевших людей и сельскохозяйственных животных, правильная интерпретация результатов РМА представляет определенные трудности. Положительная реакция с лептоспирами может явиться следствием острой, ранее перенесенной инфекции, активной вакцинации, «проэпидемичивания». Это обстоятельство требует исследования парных сывороток, взятых с 7-10 дневным интервалом (особенно при спорадических заболеваниях), а также тщательного собирания анамнеза у лихорадящих при подозрении на лептоспироз для дифференциации «острых» реакций от «анамнестических». Повышение титра антител при повторном исследовании свидетельствует об активно протекающей инфекции.

Однократная проверка сывороток больных считается достоверной при высокой концентрации агглютининов (1:3200 и выше) и наличии характерных для лептоспирозов клинических и эпидемиологических данных. Для установления серологического диагноза при групповых заболеваниях достаточно однократного исследования на 15-20-й день от начала болезни.

При оценке результатов РМА следует иметь в виду возможное тормозящее влияние на выработку антител антибиотиков (в больших дозах) и особенно специфического поливалентного гаммаглобулина, применяемого в терапевтических целях. Введение этого препарата нередко приводит к позднему появлению антител (в низких титрах, без выраженной динамики), а в ряде случаев и к полному их отсутствию (Е. М. Попова и Н. А. Стоянова, 1975). Поэтому наличие негативных реакций у больных, получивших гаммаглобулин, не исключает лептоспирозной этиологии заболевания и не является основанием для отмены диагноза при наличии выраженных клинических явлений и соответствующего эпиданамнеза.
Несмотря на то, что реакция микроагглютинации является основным, высокоспецифичным методом серологической диагностики лептоспирозов, она продолжает оставаться малодоступной для широкой сети практических лабораторий ввиду необходимости постановки ее с живыми культурами лептоспир и сложности учета. В последние годы предложены убитые диагностикумы для реакций связывания комплемента (Н. Н. Тарасевич, 1972), непрямой гемагглютинации и пассивного гемолиза (Е. П. Бернасовская и соавт., 1973), микроагглютинации (Ю. В. Батков, 1971) и разработаны методики постановки этих реакций. Однако в связи с отсутствием производственного выпуска соответствующих диагностикумов эти тесты до сих пор не нашли широкого применения в практике.

Для серологической диагностики лептоспирозов животных Ю. П. Малаховым и И. А. Логиновым (1971) разработаны сухие убитые моно- и полиантигены для реакции макроагглютинации на стекле. Методы микробиологического исследования, применяемые в условиях ветеринарных учреждений, подробно изложены в «Методических указаниях по лабораторной диагностике лептоспирозов животных» (Главное Управление ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР, М., 1975). Схема лабораторного исследования на лептоспирозы представлена на рис. 2.

Рис. 2. Схема лабораторного исследования на лептоспирозы

Применение комплекса микробиологических методов имеет не только диагностическое значение, дающее возможность установить лептоспирозную природу заболевания, но позволяет также решать существенные для эпидемиологической практики вопросы: о географии лептоспирозов, резервуарах и источниках инфекции, этиологической структуре очагов, их сопряженности и сочетанности с другими зооантропонозами эпидемиологической и эпизоотической проявляемости. При помощи лабораторного исследования возможно установить инфицированность патогенными лептоспирами внешней среды (водоемов, почвы), определить состояние иммунитета населения и иммунологическую эффективность прививок.

Обнаружение источников инфекции среди животных

Исследование мелких млекопитающих, сельскохозяйственных, домашних и промысловых животных важно не только для установления частоты и длительности лептоспироносительства, но и для определения видового состава зараженных животных, выявления основных биологических хозяев различных лептоспир, установления границ природных очагов, их стациальной приуроченности, структуры и активности. С этой целью проводят комплексное микробиологическое исследование: микроскопию мочи, органов, абортированных плодов крупного рогатого скота и свиней, посев их в питательную среду, заражение лабораторных животных, исследование крови на наличие антител. Метод прямой микроскопии в сочетании его с бактериологическим способом значительно повышает возможность обнаружения лептоспировыделителей.

Исследование водоемов и почвы на зараженность лептоспирами

Вода является важнейшим фактором передачи патогенных лептоспир; последние переживают в водоемах в течение месяца. Исследованию подлежат вода и придонный ил. Прямой микроскопии подвергается осадок, полученный центрифугированием воды при 10000 об1мин или смыв с ультрамембранного фильтра № 1. Для выделения лептоспир бактериологическим методом к 300 мл исследуемой жидкости прибавляют фосфатный буфер (pH 7,2), 1 мл свежего куриного желтка и 1 мл растопленного агара. Смесь разливают в чашки Петри и выдерживают при температуре 28-30°; микроскопирование проводят с интервалами в 5 дней.

При наличии в пробах воды лептоспир их очищают от посторонней микрофлоры путем фильтрации с последующим посевом фильтрата в жидкую питательную среду или центрифугированием смешанной культуры и засевом надосадочной жидкости на чашки Петри с сывороточным агаром (1 г агара, 100 мл фосфатной смеси pH 7,2, 10% нормальной кроличьей сыворотки). Через 10 дней содержания посевов при 30° участки агара без видимого роста переносят в пробирки с жидкой средой. Выросшую чистую культуру идентифицируют в реакции микроагглютинации с типовыми сыворотками. Для выделения лептоспир из воды применяют также метод биопроб: морским свинкам, золотистым хомякам вводят воду подкожно или скарифицируют им кожу брюшка и лапок и погружают эти участки тела в воду на 2 часа. При подъеме температуры у животных до 40° и более производят посев крови из сердца, а в случае гибели – мочи, взвеси печени и почек. В случае «немого» инфицирования критерием зараженности животных является положительный результат серологического исследования.

При эпидемиологическом изучении очагов имеет значение исследование почвы для установления инфицированности ее животными-лептоспировыделителями и длительности сохранения возбудителя в условиях повышенной увлажненности. С этой целью используют метод биопробы на золотистых хомяках, которым внутрибрюшинно вводят 0,2-1,0 мл суспензии образцов почвы; наличие возбудителя регистрируется по его присутствию в моче зараженных животных. Данный способ позволяет обнаружить лептоспиры даже в тех случаях, когда прямая микроскопия исследуемых проб почвы дает негативные результаты (Ю. Г. Чернуха и С. В. Зайцев, 1975).

Определение краевой этиологической и иммунологической структуры лептоспирозов, эффективности специфической вакцинации

Широкое и систематическое бактериологическое и серологическое обследование людей, мелких млекопитающих, сельскохозяйственных и других животных позволяет определить «пейзаж» патогенных лептоспир и фиксировать изменения в циркуляции различных серотипов, происходящие в определенные отрезки времени. Знание краевой этиологической структуры следует учитывать при конструировании профилактических, лечебных и диагностических препаратов для использования их в условиях конкретных административных территорий.

При проведении широкой эпидемиологической и эпизоотологической разведки в отношении лептоспирозов наиболее широко применяют серологический метод, имеющий важное значение для:

• ретроспективной диагностики в целях выявления людей и сельскохозяйственных животных перенесших лептоспирозную инфекцию, что позволяет установить действительную зараженность их лептоспирами;
• определения иммунологической структуры населения, в том числе наиболее «угрожаемых» (в отношении лептоспирозов) профессиональных контингентов. При обследовании здоровых лиц даже низкие титры антител (1:20, 1:40) являются критерием их инфицированности;
• выяснения эффективности вакцинации; при этом проводится выборочная проверка привитых спустя 2-4 недели после окончания прививок; высота титров антител является показателем степени их иммунности.

Широкое применение комплекса микробиологических методов при изучении эпидемиологии и эпизоотологии лептоспирозов будет способствовать выяснению основных тенденций и особенностей развития эпидемического и эпизоотического процессов, правильное понимание которых важно в связи с задачами прогнозирования, планирования и проведения профилактических и противоочаговых мероприятий и ландшафтно-эпидемиологического районирования.