Система C4

Система четвертого компонента сывороточного комплемента, или система C4, групповые полиморфные протеины которой являются глобулинами, – одна из самых сложных и полиморфных сывороточных систем крови человека, открытых за последнее время. Впервые электрофоретическую гетерогенность протеинов в области (Рг-сывороточных глобулинов описали S. Rosenfeld и соавт. (1969). Позднее, с развитием и совершенствованием техники электрофоретического анализа сложный полиморфизм протеинов области С4 был систематизирован в групповом отношении. Это позволило выдвинуть гипотезу о генетической обусловленности полиморфных белков С4 и даже создать формально-генетическую модель наследования групп системы С4, правильность которой подтверждена последующими семейными обследованиями.

В настоящее время считается доказанным, что сложный генетически детерминированный полиморфизм сывороточной системы С4 обусловлен действием множественных аллелей в едином (или в двух или нескольких тесно сцепленных генных локусах этой системы), который (или которые) очень близко расположен к генному локусу системы тканевых антигенов (HLA-B) на аутоеомальной хромосоме № 6 Причем результаты семейных обследований, исследований пар мать – ребенок и близнецов свидетельствуют о простом кодоминантном аутосомальном порядке наследования групп системы С4; этот порядок и гаплотипичный, подобный наследственной передаче групповых антигенов и фенотипов систем MNSs, Rh, HLA, От и Ag. В. Olaisen и соавт.

(1979) показали, что в генном локусе (или локусах) системы С4 имеются по крайней мере семь гаплотипов, которые теоретически могут составить при хромосомных делениях 28 (!) различных гаплотипических или генотипических комбинаций. Подавляющее большинство таких комбинаций легко устанавливаются с помощью электрофоретических или изоэлектрофокусических методов, выявляющих тот или иной фореграммный спектр или фенотип белков С4 (рис. 12).

Рис. 12. Диаграмма семи различных С4-гаплотипических продуктов (F, I, М, S, Т, FS, DS) после высоковольтного электрофореза в геле агарозы с последующей фиксацией протеинов С4 преципитирующей сывороткой анти-С4.

В. Qlaisen и соавт. (1979) собрали данные обследования 89 норвежских семей с 327 детьми, а также результаты анализа большой серии сывороток крови не связанных родством жителей Норвегии. Фенотипы сывороточной системы G4 определяли по методу P. Teis berg и соавт. (1976) с небольшими модификациями. Цельные обработанные гепарином образцы сывороток крови в количестве около 8 мкл подвергали высоковольтному (40 В/см) электрофоретическому разделению в 1% геле агарозы в течение 2 ч с использованием циркулирующей охлаждающей системы. Для электрофореза применяли непрерывную буферную систему: переходный буфер – 0,05 М трис, 0,0034 М лимонная кислота, 0,017 М борная кислота, 0,0078 М NaOH (pH 8,65). В качестве гелевого буфера использовали переходный буфер, разведенный дистиллированной водой 1:1. Для приготовления агарозного геля применяли химически чистый препарат агарозы типа HSB фирмы Glostrup (Дания). Для иммунной фиксации белков С4 использовали моновалентные иммунные преципитирующие сыворотки анти-С4 американского и английского производства.

На основании полученных данных (табл. 18) была доказана правильность формально-генетической модели наследования фенотипов С4.

Согласно модели, в генном локусе (или тесно сцепленных генных локусах системы С4) действуют семь различных аллелей или гаплотипов (генных комплексов или аллельных сочетаний), которые и обусловливают исключительно широкий и сложный генетически детерминированный полиморфизм этой сывороточной системы. Ценность семейных обследований, проведенных В. Olaisen и соавт. (1979), заключается в следующем:

1. Исследуя не такое уже большое число семей (89), авторы смогли выявить всего лишь среди 505 обследованных (178 родителей и 327 детей) 19 различных фенотипов системы С4 из 28 теоретически возможных которые могут реализоваться при наличии 28 генотипических комбинаций, возникающих при наследственной передаче одного из семи гаплотипов системы С4 от отца и матери своему ребенку. Это 15 фенотипов (FSFS, FSF, FS, FF, FSM, FSS, SS, FM, FSI, FSDS, TDS, MS, SDS, St, MDS), которые были обнаружены хотя бы у одного из родителей, и 4 фенотипа (ММ, FI, SI и FSt), найденные только у детей, 9 других возможных фенотипов обнаружены не были (гомозиготные C4tt, II и DSDS, гетерозиготные DSI, DSt, It, МТ, Ft и MI). Очевидно, невыявление девяти фенотипов в данной семейной выборке связано с довольно редкой частотой встречаемости трех (DS, I и t) из семи гаплотипов в генном локусе (локусах) системы С4.
2. По-видимому, по фореграммам белков G4 можно четко определить 26 или 28 возможных фенотипов системы G4, каждый из которых отражает единственно возможную для этого фенотипа генотипическую или гаплотипическую комбинацию. Этот факт имеет огромное значение для использования системы G4 в популяционногенетических, антропологических и судебно-медицинских исследованиях, особенно в судебно-медицинских экспертизах спорного отцовства. Два фенотипа – C4FS и C4FSFS – электрофоретически не различаются. Так, выявлены 4 родительские пары с фенотипами C4FSFXC4FSS, в этих семьях было 13 детей. У 4 детей четко определены фенотипы C4FSF (у 2 детей) и C4FSS (у 2 детей). У 9 детей фореграммный спектр белков С4 мог соответствовать как фенотипу C4FSFS, так и фенотипу G4FS. Из этого следует, что у лиц с фенотипом C4FS (C4FSFS) остается неизвестной их истинная гаплотипическая комбинация (F/S или FS/FS), хотя и в том и в другом случае возможность рождения детей от указанных родительских пар не исключалась.
3. Семейные обследования подтвердили правильность формально-генетической гипотезы о контролировании полиморфизма сывороточной системы С4 семью различными гаплотипами, частота встречаемости которых в соответствующем генном локусе (локусах) системы С4 далеко не одинакова. Обследования семей, а также не связанных родством лиц позволили вычислить частоту встречаемости семи гаплотипов системы С4, контролирующих ее полиморфизм, для населения Норвегии.
4. Доказан простой кодоминантный аутосомальныйпорядок наследования всех гаплотипов системы G4, обусловливающий появление 28 возможных гаплотипических сочетаний, следовательно, и фенотипов системы С4.

В пользу этого свидетельствует тот факт, что ни в одной из обследованных 89 семей не было отмечено рождения хотя бы одного ребенка, фенотип которого противоречил бы общепринятому правилу наследования фенотипов, или групп, этой системы. Более того, авторы наблюдали 11 так называемых «критических» пар, в которых оба родителя имели гомозиготную одинаковую или различную гаплотипическую комбинацию по аллелям генного локуса (локусов) системы С4 и должны были передать по наследству своим детям (если, естественно, генетическая гипотеза порядка наследования групп системы С4 соответствует истине) также единственно возможную гомо- (в первом случае) или гетерозиготную (во втором случае) гаплотипическую комбинацию аллелей системы G4, обусловливающую появление единственно возможных для них гомо- или гетерозиготных фенотипов С4. Родившиеся в этих семьях 47 детей действительно имели единственно возможный фенотип С4 с учетом фенотипов этой системы у их родителей. Так, в одной «критической» семье C4FFXC4FF могли родиться дети только с таким же гомозиготным фенотипом и, действительно, все 6 детей в этой семье имели фенотип C4FF. В другой семье G4SSX XC4FSFS могли родиться дети с единственно возможным гетерозиготным фенотипом C4SFS – все 5 детей этой семьи его и имели. В трех «критических» семьях C4FFXC4FSFS родилось 10 детей с единственно возможным для них гетерозиготным фенотипом C4FFS, и, наконец, в шести семьях, где оба родителя имели одинаковый гомозиготный фенотип C4FSFS, родилось 26 детей также с единственно возможным для них гомозиготным фенотипом C4FSFS.

P. Teisberg и соавт <1976), G. Mauff и соавт. (1978) обнаружили еще две крайне редкие гаплотипические гомозиготы этой системы DS/DS (фенотип C4DSDS) и 1/1 (фенотип C4II), характеризующиеся соответствую- щими фореграммными спектрами белков С4, которые являются непосредственными генетическими продуктами гаплотипов DS и I (см. рис. 12).

Все изложенное выше позволяет признать перспективность использования генетически обусловленной сывороточной системы G4 в судебно-медицинских экспертизах в делах о спорном происхождении ребенка. При применении в таких экспертизах только одной системы G4 вероятность исключения мужчины, не являющегося фактическим отцом ребенка, будет очень высокой – около 30– 35%.

Значительное преимущество электрофоретических или нзоэлектрофокусических разделительных методов, при помощи которых выявляют генетически детерминированный полиморфизм многих сывороточных и ферментных систем крови человека, перед серологическими и иммунологическими методами заключается в том, что большинство фореграмм соответствующих белков, а также изоферментные спектры тех или иных ферментов определяют фенотип, которому соответствует единственно возможная генотипическая комбинация. Это в полной мере относится и к системе С4, 26 из 27 фенотипам которой соответствует единственно возможный для этого фенотипа гаплотип.

Поэтому при использовании этой системы в судебно-медицинских экспертизах спорного отцовства эксперту почти во всех случаях не требуется расширенного исследования фенотипов системы С4 у ближайших родственников проходящих по делу лиц, как это необходимо, например, при анализе систем Rh, MNSs, Gm и др. И лишь при одном фенотипе системы G4–C4FS(FSFS) – эксперт не знает точного гаплотипического сочетания (F/S или FS/FS), соответствующего этому фенотипу. В данном случае для решения вопроса о происхождении ребенка необходимо провести исследование фенотипов С4 у ближайших родственников проходящих по делу лиц с целью выявления истинных гаплотипов С4 у ребенка и его предполагаемого отца.Например, ребенок, его мать и предполагаемый отец имеют один и тот же фенотип C4FS(FSFS). Такая возможность не так уж редка, если учесть частоту встречаемости трех гаплотипов, которые могут участвовать в двух возможных гаплотипическких комбинациях этого фенотипа: 54% FS, 22% F, 14% S.

Вполне понятно, если у ребенка и ответчика одни и те же гаплотипические комбинации из двух возможных (F/S или FS/FS), то отцовство ответчика в отношении данного ребенка по этой системе, естественно, не исключается. При различных же гаплотипах FS/FS у ребенка и F/S у ответчика и наоборот ответчик не может быть отцом ребенка. Исследования фенотипов С4 у родителей ответчика и матери ребенка показали следующее. Мать матери ребенка имела фенотип C4FSDS, а отец – C4FSM. Этим определялся истинный гаплотип системы С4 у их дочери – матери ребенка и самого ребенка, генотип которого мог быть только FS/FS. Естественно, что гаилотипично гомозиготная мать FS/FS передала по наследству своему ребенку гаплотип FS, такой же гаплотип ребенок унаследовал от отца. Мать ответчика (отца уже не было в живых) имела фенотип C4SS с единственно возможным генотипом S/S, что определяло и единственно возможный генотип ответчика – F/S, Таким образом эксперт смог вполне аргументированно исключить ответчика в качестве отца данного ребенка, поскольку в его гаплотипическом наборе отсутствовал гаплотип FS.

Приведенный пример доказывает необходимость исследования фенотипов, генотипов и гаплотипов многих систем крови у ближайших родственников, проходящих по делу о спорном отцовстве, когда у эксперта есть достаточные основания полагать, что такой анализ не исключает возможности выявления до этого неизвестного ему генотипа или гаплотипа ребенка и его предполагаемого отца. Мы понимаем, что внедрение в судебно-медицинскую экспертную практику полиморфной сывороточной системы С4 сопряжено с известными трудностями (применение высокочувствительных электрофоретических методов, дефицит иммунной преципитирующей моновалентной сыворотки анти-С4). Однако эта система вполне заслуживает того, чтобы хотя бы в крупных лабораториях или центрах нашей страны, углубленно изучающих современные проблемы судебно-медицинской экспертизы спорного отцовства, она была взята на практическое вооружение.