Система эритроцитарной фосфоглюконатдегидрогеназы
Фосфоглюконатдегидрогеназа (ФГД) (КФ 1.1.1.44) катализирует реакцию декарбоксилирования 6-фосфоглюконата (6-ФГ) в рибулозо-5-фосфат. R. Fildes и С. Parr (1963) с помощью электрофореза в крахмальном геле впервые выявили генетически детерминированные варианты эритроцитарной 6-ФГД у человека. При исследовании гемолизатов эритроцитов крови 150 не связанных родством англичан авторы установили, что в крови большинства обследованных лиц (140) находился один эритроцитарный изофермент ФГД, в то время как у 10 других наблюдались тройные изоферменты, отличавшиеся в некоторых образцах по интенсивности. Посемейные обследования свидетельствовали об аутосомальном кодоминантном порядке наследования этих вариантов.
N. Carter и соавт. (1968) на обширном материале, включавшем результаты обследования 4558 жителей Лондона, показали, что обычный фенотип ФГД (Usual phenotype, или фенотип А), характеризующийся одним изоферментом, наблюдается приблизительно в 95% случаев. Приблизительно в 4% случаев простой вариант -ФГД (Common variant, или фенотип АВ) характеризовался тремя изоферментами, обозначенными как с, b и а по возрастающей скорости миграции к аноду, причем интенсивность их уменьшалась от изофермента а к изоферменту с. Приблизительно у 1% обследованных лиц наблюдался несколько иной электрофоретический вариант с теми же тремя изоферментами а, b, с, однако их выраженность, уменьшалась в противоположном порядке – от изофермента с к изоферменту а. Этот вариант ФГД по фамилии человека, у которого он был впервые обнаружен, назвали Canning variant, или фенотипом В. Авторы создали формально-генетическую модель наследования групп эритроцитарной ФГД, согласно которой в едином аутосомальном генном локусе системы ФГД действуют два кодоминантных аллельных гена ФГДа и ФГДЪ, обусловливающих появление генотипических фенотипов двух гомозиготных ФГД-А и ФГД-В (генотипы ФГД*/ФГД* и ФГДЬ1ФГДЬ) и одного гетерозиготного ФГД-АВ (генотип ФГД*/ФГДЪ). Значительное преобладание частоты встречаемости фенотипа ФГД-А над фенотипом ФГД-АВ и тем более над фенотипом ФГД-В свидетельствовало также и о том, что в генном локусе системы ФГД частота встречаемости аллеля ФГДа выше частоты встречаемости аллеля ФГДЬ.
Кроме трех основных фенотипов системы 6-ФГД обнаружены и довольно редкие атипичные электрофоретические варианты, наследственная передача которых доказана в семейных обследованиях. В настоящее время известны по крайней мере 12 атипичных вариантов ФГД, которые в основном генотипически гетерозиготны но одному из атипичных аллелей этой системы и по одному из основных аллелей ФГДа (значительно чаще) или ФГДь (значительно реже). Это фенотипы ФГД-AR [генотип ФГД3/ФГДК (Richmond)] и ФГД-AH [генотип ФГДа/ФГДн (Hackney)], ФГД-AF [генотип ФГД*/ФГД* (Friendship)], ФГД-AF1 [генотип ФГДа/ФГДР1 (Freiburg)], ФГД-АЕ [генотип ФГДа/ФГДЕ (Elcho), ФГД-AN [генотип ФГДа/ФГДп (Neath)]. Помимо указанных шести гетерозиготных атипичных фенотипов эритроцитарной ФГД, появление которых обусловлено действием шести редких аллелей в генном локусе этой системы, N. Blake и соавт. (1974) описали еще несколько необычных электрофоретических вариантов фермента, генетическая обусловленность которых также подтверждена.
Учитывая отличительный изоферментный спектр этих -фенотипов ФГД не только от трех основных, но и от шести других ранее описанных атипичных фенотипов, предполагают, что в генном локусе системы ФГД существуют еще шесть редких атипичных аллелей. Два из них ФГДw (Wantoat) и ФГДСап (Canberra) обусловливают появление медленно мигрирующих атипичных изоферментов ФГД, а четыре других аллеля ФГДК (Kadar), ФГДСяs (Caspian), ФГДВот (Bombey) и ФГДНаХ (Natal) – необычных изоферментов, электрофоретическая подвижность которых превышает скорость миграции основного изофермента а в генотипически гомозиготном фенотипе ФГД-А. Атипичные фенотипы фермента, появление которых обусловлено действием названных выше аллелей, также в основном генотипически гетерозиготные по атипичному и основному аллелю ФГДа. В двух случаях Blake и соавт. наблюдали генотипически гетерозиготные фенотипы ФГД по атипичному аллелю этой системы и основному аллелю ФГДЪ. Более того, в одном случае был выявлен гомозиготный фенотип ФГД-К (Kadar) (генотип ФГДК/ФГДК).
На рис. 17 изображены групповые изоферментные спектры трех основных и пяти атипичных фенотипов системы ФГД, выявляемых с помощью электрофореза. Наиболее распространенным методом обнаружения групповых изоферментов ФГД является электрофорез в крахмальном геле, предложенный R. Fildes и С. Рагг (1963).
Рис. 17. Схематическое изображение трех основных (А, АВ, В) и пяти атипичных фенотипов (AR, АН, AF, АЕ, AN) 6-фосфоглюконатдегидрогеназы.
Для электрофореза применяют непрерывную цитратную буферную систему с pH 6,0. Переходным (электродным) буфером служит цитратный буфер с 0,1 М электролита, гелевый буфер содержит лишь 0,002 М цитратного электролита. Электрофорез проводят 5–6 ч при +4–6 °С и напряжении 7,5–8,5 В/см.
Для выявления активности ФГД применяют агаровую аппликацию. Инкубационная смесь: к 20 мл трис-буферу с pH 8,0 (на 1 л дистиллированной воды 12,1 триса, 3,7 г ЭДТА, 26,8 мл 2 N НС1 и 10 мл М раствора MgCl2) добавляют 100 мг растворимого агара. Смесь подогревают на водяной бане до полного растворения агара. После охлаждения раствора до 40 °С в него добавляют 20 мг 6-ФГ, 4 мг НАДФ, 4 мг МТТ и 1мг ФМС. После растворения реагентов смесь выливают на поверхность крахмального геля и инкубируют при 37 °С в течение 20–30 мин до появления фиолетовых зон формазана. Выявление активности 6-ФГД основано на следующем. 6-ФДГ переводит 6-ФГ в рибулозо-5-фосфат с восстановлением НАДФ и НАДФНг в присутствия МТТ и ФМС обусловливает цветовую химическую реакцию, при которой нерастворимые фиолетовые гранулы формазана выпадают в осадок в местах проявления ферментативной активности (методика приведена ниже).
Частота встречаемости аллелей ФГД* и ФГДЪ среди различных популяций составляет в среднем соответственно 95 и 5%. Значительное преобладание частоты встречаемости аллеля ФГДа над частотой встречаемости аллеля ФГДЪ делает систему 6-ФДГ относительно мало информативной в судебно-медицинских экспертизах спорного отцовства. Так, по данным R. Chakraborty (1974), вероятность исключения отцовства по этой системе составляет в среднем для европеоидных, монголоидных и негроидных популяций соответственно 2,29; 5,86 и 3.35%. В то же время многочисленные атипичные варианты ФГД, передающиеся по наследству, часто могут способствовать установлению истинных родителей.
Система ФГД эритроцитов является довольно сложной, поскольку ее генетически обусловленный полиморфизм не ограничивается только электрофоретическими вариантами, а проявляется и в различной ферментативной активности. У некоторых людей обнаружили частичный дефицит активности 6-ФДГ, который передается по наследству, что свидетельствует о генетической обусловленности такого дефицита. Тот факт, что наследственные варианты ФГД, связанные с частичным дефицитом активности фермента, выявлены только у лиц, имевших якобы генотипически гомозиготные электрофоретические фенотипы ФГД-А и ФГД-В, и ни в одном случае не обнаружены у лиц с гетерозиготным фенотипом ФГД-АВ, свидетельствует о гетерозиготности не только по основному аллелю ФГДа или ФГДЬ, но и какому-то другому аллелю, обусловливающему снижение ферментативной активности ФГД.
N. Carter и соавт. (1968) описали два вида такого уменьшения ферментативной активности у лиц с фенотипом ФГД-А. В одних случаях наблюдалась активность ФГД, составляющая 50–60% нормальной активности, в других случаях – 75–80%. Авторы предположили, что в данных случаях существовала наследственная передача двух разных атипичных аллелей, каждый из которых в различной степени обусловливает снижение ферментативной активности. В дальнейшем это предположение было подтверждено семейными обследованиями, в которых наблюдалась наследственная передача строго определенного в количественном отношении снижения активности ФГД.
По фамилии лица, у которого впервые был выявлен генетически детерминированный дефицит активности ФГД, составляющий 50–60% от нормы, фенотип обозначили Ilford variant. Считают, что гепотипически он характеризуется гетерозиготной формой по аллелю ФГДа и атипичному аллелю ФГД0, обусловливающему 40–50% -снижение активности ФГД в эритроцитах крови человека. Другой фенотип ФГД, при котором активность фермента снижена лишь на 20–25% по сравнению с нормой, так как по фамилии лица, у которого он был впервые выявлен, назвали Dalston variant. Полагают, что этот фенотип также генотипически гетерозиготный по основному аллелю ФГД3 и аллелю ФГД™.
Кроме этих двух гетерозиготных фенотипов, при которых активность ФГД в эритроцитах снижена, найдены еще два: Newham variant и Whitechepel variant. Первый из них представляет собой гетерозиготную форму (генотип ФГД3/ФГД0), активность 6-ФГД в этом случае составляет 40–50% от нормы. Второй вариант являетсй генотипически гомозиготным фенотипом ФГД-W (генотип ФГД™/ФГД™), активность фермента при этом варианте составляет всего 1–5% от нормы.
Наличие в генном локусе системы ФГД «скрытых», или «немых», аллелей ФГД° и ФГД™, снижающих в комбинации с обычными аллелями ФГДа или ФГДь активность фермента, всегда нужно учитывать при судебно- медицинских экспертизах спорного происхождения детей» Особое внимание следует обращать на исключение возможности отцовства (материнства) по противоположной гомозиготности (например, ответчик или мать ребенка имеет фенотип ФГД-А, а ребенок – фенотип ФГД-В и наоборот). Во всех таких случаях во избежание ошибочной трактовки противоположной гомозиготности, маскирующей истинную гетерозиготность (ФГД3/ФГД0 или ФГД3/ФГД™ и ФГДЪ/ФГД° или ФГДЪ/ФГД™), эксперт должен в первую очередь учитывать интенсивность окрашивания групповых изоферментов ФГД у всех проходящих по делу лиц. При снижении такой выраженности изоферментов у ребенка и «исключившихся» ответчика или матери ребенка всегда следует думать о возможности наследственной передачи ребенку одного из аллелей ФГД0 или ФГДw, обусловливающих снижение активности эритроцитарной ФГД. Для выяснения этого судебно-медицинский эксперт должен провести расширенное исследование групп ФГД у ближайших родственников проходящих по делу лиц, а также точный количественный анализ активности фермента в эритроцитах крови.
Активность ФГД определяют с помощью следующего метода. Гемолизаты эритроцитов (1 :50) готовят путем смешивания 0,1 мл дельной крови с 4,9 мл дистиллированной воды. Через 1 мин смесь центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин и прозрачный гемолизат сразу же фотоколориметрируют. Половину гемолизата помещают в кювету, к нему добавляют 1 мл 0,3 М трис-бу<Ьепа pH 8,0, 0,3 мл 0,1 М MgCl2, 0,1 мл 18 мкМ натриевой соли 6-ФГ 1.4 мл дистиллированной воды. Вторую порцию гемолизата помещают в другую кювету, к нему для выявления суммарной активности ФГД и Г6ФД добавляют те же реагенты и 0,1 мл 18 мкМ раствора натриевой соли Г6Ф. Реакция начинается после добавления в обе кюветы по 0,1 мл 6 мкМ раствора НАДФ. Оптическую плотность (Е) определяют с интервалом в 1 мин в течение 10 мин при длине волны Я 340 нм. Контроль – оптическая плотность раствора, содержащего 0,5 мл гемолизата, 1 мл 0,3 М трис-буфера pH 8,0 и 1,5 мл дистиллированной воды. Концентрацию гемоглобина определяют при Я=540 нм по отношению к оптической плотности дистиллированной воды. Активность эритроцитарной ФГД выражают в международных единицах (ME) по формуле.
В настоящее время считается доказанным, что генный локус системы ФГД, так же как и генный локус системы ФГМ1, может располагаться либо на коротком плече, либо на проксимальной части длинного плеча хромосомы Nil.
