Система СЗ (посттрансферринов)
О полиморфизме третьего компонента комплемента сыворотки крови человека (компонент СЗ, или (Jic-глобулин) впервые сообщили С. Ropartz и соавт. (1965). В период с 1967 по 1969 г. различные группы исследователей независимо друг от друга с помощью электрофоретических методов доказали существование генетически детерминированного полиморфизма в области с-глобулинов сыворотки крови человека, не связанного со всеми ранее известными сывороточными групповыми системами. Естественно, что каждая группа исследователей давала собственную номенклатуру или обозначение этой новой сывороточной системе.
Так, А. В. Wieme и Н. Segers (1968), используя электрофорез в агаровом геле, выявили генетически обусловленный электрофоретический вариант СЗ-компонента (СЗ-полиморфизм), на фореграмме он разделился на две части. Ch. Alper и R. Р. Ргорр (1968) с помощью высоковольтного электрофореза в геле агарозы подтвердили существование Генетически детерминированного СЗ-полиморфизма. Авторы предположили, что этот полиморфизм обусловлен действием в соответствующем генном локусе сывороточной системы СЗ пяти аллелей: Fi, Fo,s, F, S и Si. Согласно этой гипотёзе, сывороточная система СЗ имеет 15 возможных генотипических комбинаций, реализующих появление (15 различных ее фенотипов.
Е. A. Azen и О. Smithies (1968) также наблюдали генетически детерминированный полиморфизм pic-глобулиновой сывороточной системы. Эти исследователи предложили новую цифровую номенклатуру аллелей, обусловливающих полиморфизм системы СЗ. И, наконец, М. Rose и G. Geserick (1969) смогли доказать, что генетически обусловленный полиморфизм этой системы электрофорети- чески выявляется в области, непосредственно располагающейся после (к катоду) зоны генетически детерминированных компонентов сывороточного трансферрина. По предложению авторов эта полиморфная система была названа системой посттрансферринов (Pt). Аллели, определяющие ее полиморфизм, по аналогии с аллелями системы трансферринов обозначили как Pta, Ptb и Ptc. Таким образом, из пятиаллельной генетически обусловленной системы система СЗ (или посттрансферринов) превратилась в трехаллельную кодоминантную генетически обусловленную систему с шестью возможными генотипическими комбинациями и, следовательно, с шестью фенотипами, или группами, пять из которых обнаружили М. Rose и G. Geserick.
Результаты семейных обследований, проведенных М. Rose и G. Geserick, и вычисленные на их основе частоты встречаемости аллелей, обусловливающих полиморфизм системы G3, дали возможность авторам вполне аргументированно выдвинуть гипотезу о существовании в генном локусе данной системы трех (а не пяти) основных аллелей (Pta, Ptb и Ptc). Эта гипотеза не исключает существования довольно редких (атипичных) аллелей, генетические продукты которых, необычные СЗ-компоненты, по-видимому, и наблюдали Ch. Alper и R. Р. Ргорр (1968), выдвинувшие пятиаллельную генетическую гипотезу наследования СЗ-компонента.
На рис. 10 показаны фореграммы посттрансферринов шести основных фенотипов А, АВ, В, ВС, С и АС. Черным цветом обозначены компоненты посттрансферринов (максимальная интенсивность) трех гомозиготных фенотипов Pt А, В и С; компоненты в трех гетерозиготных фенотипах АВ, ВС и АС заштрихованы, остальные обозначения – малоинтенсивные «микрофракции», характерные для всех шести основных фенотипов Pt.
Рис. 10. Фореграммы (схема) Pt различных фенотипов [по Rose М., Geserick G., 1969]. 1 – компоненты гомозиготных типов; 2 – компоненты гетерозиготных типов; 3 – слабо интенсивные компоненты.
Почти абсолютная идентичность СЗ- и Pt-полиморфизма, доказанная М. Rose и G. Geserick (1969), помогла понять и основную ошибку Ch. Alper и R. Р. Ргорр (1968), которые при высоковольтном электрофорезе в геле агарозы наблюдали, по-видимому, не только генетически детерминированный полиморфизм посттрансферринов, относящихся к Рla-глобулинам, а «расширенный» полиморфизм СЗ, захватывающий и область pi с-глобулинов. Кроме того, М. Rose и G. Geserick экспериментировали со свежими образцами сывороток крови, Ch. Alper и R. Р. Ргорр (1968) исследовали старые консервированные образцы, и не исключено, что наблюдаемый ими «расширенный» полиморфизм СЗ был обусловлен либо добавлением к сывороткам консерванта, либо частичным распадом сывороточных р-глобулинов. Влияние старения сывороток крови на изменение фореграмм групповых посттрансферринов (кстати, индивидуальных для конкретного образца) отмечали также другие авторы, наблюдавшие изменение скорости миграции C3-, или Pt-компонентов при длительном хранении образцов сывороток.
Результаты семейных обследований свидетельствовали о простом кодоминантном аутосомальном порядке наследования групп СЗ, или Pt, о наличии трех основных и многих редких атипичных аллелей в генном локусе этой системы или тесно сцепленных сывороточных систем.
Сообщения о многочисленных новых вариантах системы СЗ или Pt, отличающихся друг от друга лишь незначительным изменением скорости миграции СЗ- или Pt-компонентов, привели к тому, что в 1972 г. состоялся международный симпозиум под эгидой ВОЗ, посвященный полиморфизму СЗ-компонента комплемента. Были рекомендованы строго определенные методы электрофоретического выявления полиморфизма СЗ или сывороточных посттрансферринов. По принятой на симпозиуме новой международной номенклатуре, два основных гомозиготных варианта СЗ, ранее обозначавшихся СЗА и СЗВ (или PtA и PtB), в соответствии со скоростью миграции их глобулиновых компонентов стали называться вариантами C3F и C3S (или PtF и PtS), а все редкие атипичные варианты – либо быстрыми, например, C3F0,5, C3F1,2 (PtF0,5; PtF 1,2), либо медленными вариантами, например, C3S0,25, C3S0,6 (PtS 0,25, PtS 0,6).
Обычный гетерозиготный вариант по новой номенклатуре называют вариантом C3FS, или PtFS, а гетерозиготные атипичные варианты, генотипически характеризующиеся сочетанием одного из обычных аллелей в генном локусе этой системы C3F или С3s (PtF или Pts) и одного атипичного аллеля этой системы, также в зависимости от электрофоретической подвижности глобулиновых компонентов, – вариантами F0,5S, FS0,4 и т. д. Все аллели в генном локусе СЗ, или Pt, обозначают C3F, С3s (основные аллели) и C3F0>S, C3SI>3 (редкие атипичные аллели).
Обнаружено более 20 редких атипичных вариантов СЗ или Pt, частота встречаемости которых в европеоидных популяциях не превышает 1%.
На обширном материале показана идентичность комплементарной сывороточной системы СЗ и системы сывороточных посттрансферринов.
Исследовали 541 образец сывороток крови различных доноров с помощью двух электрофоретических методов, позволяющих улавливать генетически детерминированный белковый полиморфизм в области как (3iC-, так и Pia-глобулинов. При электрофорезе 537 образцов получены полностью сопоставимые результаты, что позволило отнести эти образцы к одним и тем же фенотипам, или группам, сывороточных систем. При этом, как и ожидалось, фенотип C3F соответствовал фенотипу PtA, фенотип C3S – фенотипу PtB, фенотип G3FS – фенотипу PtFS. В 4’ образцах, исследованных на полиморфизм СЗ, выявлены редкие атипичные варианты, которые были идентифицировании как C3F0,65S, C3F0,6S, C3F0,55S и C3F0,5. В отношении полиморфизма посттрансферринов результаты оказались несколько иными. Так, атипичный, довольно редкий, образец C3F0,5S, генотипически гетерозиготный по обычному аллелю и атипичному аллелю (73р0,5, при использовании электрофореза диагностировался как обычный гомозиготный фенотип PtB. Три других атипичных образца сывороток СЗ соответствовали при применении Pt-электрофоретической техники гетерозиготному фенотипу PtAB, причем при многократных исследованиях этих образцов в различных условиях электрофореза не было выявлено никаких отклонений в скорости миграции Pt-компонента А.
М. Rose и G. Geserick (1969) при исследовании 407 образцов сывороток крови Болгарии обнаружили 21 различный атипичный фенотип посттрансферринов. Однако до сих пор неясно, идентичны ли все эти атипичные образцы Pt, мигрирующие в области Pia-сывороточных глобулинов, атипичным образцам СЗ с подвижностью ipic-глобулинов. На этом фоне совершенно неожиданными выглядят результаты исследования 522 образцов сывороток крови населения Берлина, в котором обнаружили лишь 5 посттрансферриновых фенотипов: А, АВ, В, ВС и АС.
В настоящее время можно заключить, что СЗ- и Pt-полиморфизм, конечно же, имеет единую генетическую природу, о чем свидетельствует почти полное совпадение частот распространения основных аллелей C3F и С3s системы СЗ и основных аллелей Pta и Ptb системы Pt среди европейского населения, которые составляют в среднем соответственно 20 и 80%. Поэтому в большинстве современных публикаций, посвященных этим полиморфным (и тождественным!) системам, во избежание путаницы вводится единое обозначение – система третьего компонента сывороточного комплемента, или сывороточная система СЗ.
Полиморфизм системы СЗ обусловлен существованием в генном локусе этой системы двух основных аллелей C3F п C3S и, по-видимому, множества редких атипичных аллелей, ответственных за появление трех основных (C3FF, C3FS и C3SS) и множества редких атипичных фенотипов. Последние генотипически чаще являются гетерозиготными по какому-либо атипичному аллелю и одному из основных аллелей. Однако уже найдены гетерозиготные и даже гомозиготные фенотипы СЗ только по атипичным аллелям этой системы, например C3F0,5S1,5; C3S1,5S0,5 и др.
Генетически детерминированный полиморфизм системы СЗ уже применяется в судебно-медицинских экспертизах спорного отцовства. Высокая частота встречаемости основных аллелей системы СЗ (особенно среди европеоидных популяций) делает ее весьма информативной в подобных экспертизах. Например, по данным R. Chakraborty и соавт. (1974), средняя вероятность исключения отцовства мужчин, ложно указанных в качестве отцов, только по системе СЗ составляет для европеоидных, негроидных и монголоидных популяций соответственно 15,23; 8,13 и 1,92%. По данным О. Prokop и W. Gohler (1976), вероятность исключения отцовства по системе Pt среди населения европейских стран значительно выше и составляет 20,7%.
Некоторые исследователи считают, что использовать систему СЗ в судебно-медицинских экспертизах спорного отцовства следует весьма осторожно, поскольку не так уж редко (приблизительно в 1% случаев) эксперт может встретить атипичные фенотипы СЗ, которые электрофоретически сходны с основными группами C3FF, C3FS и C3SS. Из рис. 11 видно, что некоторые атипичные гетерозиготные варианты СЗ трудно отличить от обычного гетерозиготного варианта C3FS. Поэтому во избежание экспертных ошибок некоторые авторы [Sahai S. et al., 1978, и др.] рекомендуют обязательное параллельное электрофоретическое разделение в 1% геле агарозы как исследуемых образцов сывороток крови ответчика, ребенка и его матери, так и заведомо известных контрольных образцов сывороток с тремя основными фенотипами C3FF, C3SS и C3FS (применение при электрофорезе обычного образца C3FS обязательно). Для облегчения выявления и распознавания типов СЗ рекомендуют также после электрофореза использовать иммунную фиксацию с иммунной антисывороткой, специфически осаждающей белки сыворотки крови в области ipic-глобулинов, т. е. моновалентную преципитирующую иммунную сыворотку анти-СЗ. Для этого после 30-минутного высоковольтного электрофореза в 1% геле агарозы на гель в области миграции Р-глобулинов на 5–10 мин накладывают полоску ацетатной целлюлозы, смоченную антисывороткой. Затем полоску удаляют, гель многократно промывают в дистиллированной воде. Для более четкого выявления разделенных компонентов гель окрашивают 2% водным раствором амидошварца 10В или кумасси блю В250 в смеси метанола и дистиллированной воды (2:2:1) в течение часа при 37 °С. Для последующего отбеливания в раствор для красителя вместо красителя добавляют 50% уксусную кислоту.
Рис. 11. Диаграмма электрофоретических образцов трех обычных фенотипов СЗ (S, F и FS) и пяти ее атипичных фенотипов, являющихся генотипически гетерозиотными по одному из основных аллелей (C3S или C3F) и одному из атипичных аллелей этой системы. 0–40 шкала в миллиметрах от старта до соответствующих компонентов СЗ.
Предложенный метод более надежен, чем все другие электрофоретические методы, однако необходимость в моновалентной иммунной сыворотке анти-СЗ ограничивает широкое применение метода в судебно-медицинской практике.
Следует отметить, что наличие в сывороточной системе СЗ большого числа генетически детерминированных атипичных вариантов иногда позволяет по редким фенотипам СЗ сделать аргументированное заключение о том, является ли ответчик отцом данного ребенка. Естественно, что такой вывод можно сделать только после расширенного исследования генетических маркеров различных трупновых систем крови у всех проходящих по делу лиц, не исключающего возможности рождения данного ребенка от конкретной родительской пары. Однако для четкого выявления атипичных вариантов СЗ необходимо использовать, по-видимому, все же метод иммунной фиксации СЗ-белков: после их электрофоретического разделения.
