Приборы и оборудование для лигандных технологий
Исходя из назначения, задач, перечня исследований, мощности, финансовых возможностей лаборатории, могут быть выбраны методы, а соответственно, и различные наборы реактивов, приборы и оборудование. Понятно, что выполнить любую методику, основанную на перечисленных выше технологиях, без готовых наборов реактивов для нее практически невозможно. Реактивы, необходимые для реакции, в составе того или иного набора поставляются в готовой к употреблению и концентрированной жидкой формах или в сухом виде во флаконах. Наборы содержат калибровочные и контрольные материалы, инструкцию для пользователя. Если контрольные материалы отсутствуют, то пользователь обязательно должен быть информирован о том, какие из них должны быть приобретены отдельно, а также о том, какие дополнительные реактивы необходимы для выполнения анализа.
В клинико-диагностических лабораториях наиболее распространен метод иммуноферментного анализа в планшетах с фотометрическим измерением конечного результата, который чаще всего выполняется на полуавтоматических анализаторах. При этом используют готовые наборы реактивов, в состав которых входят 96-луночные планшеты с плоским дном, на дне и стенках которыx уже адсорбированы в заводских условиях нужные антитела, рационально использовать планшеты, собранные из отдельных полосок, стрипов, на 8 или 12 проб, которые могут быть отделены от целого планшета в зависимости от количества проб для анализа.
Распределение проб (холостая проба на весь планшет или каждую пробу, калибровочные, контрольные, пробы пациентов) может быть не произвольным, а зависеть от последовательности измерения на конкретном анализаторе.
Все варианты гетерогенного иммуноанализа требуют выполнения многих последовательных операций связывания и отмывания. Трудно добиться, чтобы каждая из них проходила до конца. Кроме того, результат зависит от качества антител и способа их получения. По этим причинам в каждой аналитической серии (на каждом планшете) ставят несколько калибровочных проб, по которым проводят расчет в количественном анализе.
Калибровочный график, как правило, нелинейный; вычисления выполняют встроенным в ридер микропроцессором. Это точнее, чем вручную, что тоже возможно, но очень трудоемко. В любом случае приходится выбирать форму калибровочного графика. Способ расчета результатов, вид калибровочного графика иногда указаны в инструкциях к наборам реактивов.
Поскольку многочисленные аналитические операции — дозирование проб и реактивов, инкубация, встряхивание, ферментативная реакция, отмывание — проводят в тех же лунках, на которых были адсорбированы антитела, для выполнения на многолуночных планшетах всех предусмотренных методом процедур применяют различные устройства, позволяющие стандартизовать выполнение процедур в каждой лунке и рационализирующие работу персонала.
Планшеты на 384, 864, 1 536 лунок в клинико-диагностических лабораториях обычно не применяют. Их используют для научных исследований. Если лаборатория использует наборы реактивов, в состав которых входят планшеты, составленные из одиночных или сдвоенных микрострипов (соответственно, на 8 и 16 (2x8) проб, 12 проб), необходимо приобрести рамки по формату планшета, подходящие для данных стрипов и считывающего устройства.
Для проведения анализа в 96-луночных микропланшетах с плоским дном лаборатория должна быть обеспечена: первичными пробирками для взятия крови; центрифугой для получения сыворотки или плазмы; вторичными пробирками, в которые помещают исследуемую биожидкость после центрифугирования; дозирующими устройствами – одноканальными полуавтоматическими пипетками с фиксированными или переменными объемами доз с соответствующими насадками, многоканальными полуавтоматическими пипетками (8-, 12-канальными пипетками с переменными объемами доз с соответствующими насадками); автоклавом (при использовании автоклавируемых пипеток и насадок к ним); штативами для закрепления наконечников на многоканальных пипетках гид-планшетом; встряхивателем (шейкером) для планшетов; термостатом (инкубатором) для планшетов; промывочным устройством (вошером); ридером, или фотометром с вертикальным ходом луча для микропланшетов с набором светофильтров, позволяющим проводить измерения в соответствии с длинами волн, рекомендуемыми в инструкциях к используемым наборам реактивов.
Существуют основные устройства и оборудование, которое применяют для различных видов лабораторных исследований, и оборудование, включающее специфические для данного вида иммуноанализа (например, планшетного) приборы и устройства, которые не могут быть применены при пробирочном иммуноанализе.
Гид-планшет представляет собой устройство для рационализации работы персонала на этапе пипетирования проб и реактивов. Это планшет, на который помещают планшеты или стрипы для проведения анализа. После пипетирования пробы (или реактива) в лунку планшета для анализа лаборант нажимает специальную клавишу на гид-планшете. При этом загорается свет под этой лункой. Таким образом, уменьшается вероятность возникновения грубой погрешности в результате перепутывай ия проб или реактивов. Гид-планшет может быть соединен с пипеткой, которой выполняют пипетирование. В таком случае после помещения пробы или реактива в лунку свет под ней загорается автоматически.
В лабораториях с большой нагрузкой для пипетирования применяют высокопроизводительные дозаторы-сэмплеры (от англ. sample – проба), управляемые компьютерами. Их можно использовать как отдельные устройства или они могут быть встроены в автоматические анализаторы для иммунохимического анализа и выполнять различные операции, связанные с пипетированием, включая разведение проб на всем планшете.
Промывочные устройства – вошеры для планшетов – автоматизируют процесс добавления и удаления жидкости из лунок планшета. В некоторых методах иммуноферментного анализа рекомендуется от трех до пяти стадий отмывания планшета буфером для удаления непрореагировавших с антигеном антител или конъюгатов антител с ферментом. Это – программируемые 8- или 12-канальные устройства, в которых процесс отмывания должен быть возможен в планшетах любой конфигурации, с плоскодонными, круглыми или коническими лунками, с переменной высотой головок для внесения и аспирации жидкости (вертикальное или горизонтальное положение головки).
Конструкции вошеров для планшетов учитывают наличие планшетов с различным числом лунок, возможность работы в ручном и автоматическом режиме, различие параметров отмывки: число циклов, необходимость применения нескольких буферных растворов, объем, скорость подачи и удаления раствора из лунок, продолжительность задержки в лунках, замачивание планшета с промывочным раствором, положение каналов моющего узла относительно стенок и дна лунок, встряхивание планшета между циклами отмывки.
В зависимости от потребностей лаборатории и применяемой методики можно использовать различные модификации промывателей: ручные – 8-, 12-канальные для планшетов и стрипов представляют собой компактные устройства, в которых перемещение планшетов и стрипов выполняют вручную, промывающий раствор подается в лунки при нажатии клавиши на моющем узле, удаление жидкости из лунок происходит за счет непрерывно работающего вакуумного насоса при опускании промывающих каналов в лунки.
Возможна регулировка высоты каналов, что и позволяет использовать планшеты с различной конфигурацией дна лунок; автоматические 8-, 12-канальные промыватели, которые могут быть использованы не только при иммуноферментном, флюоресцентном или люминесцентном планшетном анализах, но и при работе с клеточным монослоем в лунках, а также с методиками, в которых в качестве носителей используют бумажные диски. Скорость подачи промывающего раствора и аспирации жидкости такова, что клеточный монослой не повреждается.
Промыватели имеют встроенный шейкер (встряхиватель), обеспечивающий линейное встряхивание с регулировкой скорости, встроенный микропроцессор для программирования большого количества протоколов по всем параметрам отмывки. Скорость отмывки 96-луночного планшета (три цикла по 300 мкл раствора на одну лунку) около 2 мин. Известны еще более автоматизированные промыватели, имеющие 96-канальный моющий узел, встроенный микропроцессор для программирования параметров отмывки, скорость отмывки 96-луночного планшета (три цикла по 300 мкл раствора на одну лунку) около 0,5 мин.
Отечественный автоматический промыватель «ПРОПЛАН» имеет 8-канальный промывочный узел; автоматизированные модели для решения различных задач, например проведения промывки в 96-луночных планшетах в исследованиях с применением магнитных бусин. Магнитная подставка под планшет удерживает магнитные бусины на дне лунок во время промывки.
Иммуноферментный анализ в планшетах является разновидностью микроанализа. Для эффективного встряхивания реакционной смеси в таких маленьких ячейках, какими являются лущу, планшета или стрипов, необходим встряхиватель. Как правило в лабораториях стараются приобрести инкубатор-шейкер, с помощью которого возможно термостатирование и встряхивание последовательно и/или одновременно. При выборе такого устрой, ства важно учитывать параметры его загрузки (количество одновременно термостатируемых и встряхиваемых планшетов); возможность термостатирования пробирок, диапазон температур и точность термостатирования; продолжительность термостатирования и встряхивания (установку времени); виды встряхивания — линейное, орбитальное, двойное орбитальное (в отличие от линейного орбитальное встряхивание обеспечивает более эффективное перемешивание содержимого лунок или пробирок) и диапазон скоростей встряхивания.
Для объективной оценки результатов иммунохимических исследований в качестве ридеров используют различные оптические приборы, при планшетном анализе – с вертикальным ходом луча: фотометры, спектрофотометры, флюорометры, люминометры. В фотометрическом иммуноферментном анализе – это фотометры и спектрофотометры. Обычно при разработке и производстве ридеров учитывают потребности и производительность лабораторий различной мощности. В том случае, если поток анализов невелик, можно применять фотометр для стрипов, на котором измеряют одинарные, двойные, тройные стрипы длиной в 8- 12 лунок либо отдельные лунки. В целом эти фотометры представляют собой анализаторы, на которых возможно программирование методик, сохранение их в памяти прибора, автоматическая установка светофильтров, расчет и вывод результатов на дисплей и распечатка их с помощью встроенного принтера, построение калибровочных графиков, сохранение калибровки в памяти прибора, возможность двухволновых измерений. Известны ридеры для 1-, 8-канального фотометрирования 96-луночных планшетов, которые помимо перечисленных выше характеристик, имеют еще встроенный шейкер с программируемым временем встряхивания и применяются в лабораториях с небольшим потоком анализов.
Компьютеризированные комплексы для иммуноферментного анализа включают в себя планшетный фотометр, персональный компьютер и программное обеспечение (например, «ИФАН»). Особенностями этого комплекса является возможность программирования и сохранения в памяти неограниченного числа методик; автоматическое управление процессом измерения; контроль результатов измерения; представление и распечатка всей основной и дополнительной информации по результатам исследований; возможность распечатки результатов в виде лабораторного журнала; автоматическое ведение данных по контролю качества, представление отчетов по проделанным исследованиям за год, по месяцам и для каждого пользователя в отдельности. Скорость измерения 96 лунок – несколько секунд.
Многие флюорометры для планшетов имеют режимы измерения флюоресценции, люминесценции и абсорбции, предназначены для планшетов различного формата. Измерения проводят с поверхности и дна лунок планшетов, по конечной точке и кинетические, возможны измерения кинетики в отдельных лунках, есть встроенный инкубационный модуль, программное обеспечение для управления прибором и обработки результатов; скорость измерения – высокая.
При выборе ридера очень важно учитывать его комплектацию светофильтрами и способ смены светофильтра (ручной или автоматический). Если в лаборатории необходимо помимо выполнения методов, основанных на иммуноферментном анализе, выполнять и иммунохимический анализ белков, следует выбрать ридер, в котором предусмотрено турбидиметрическое измерение и на длине волны 340 нм. При работе с наборами реактивов, в которых в качестве метки используется щелочная фосфатаза, конъюгированная с антителами против исследуемого антигена, и в качестве субстрата – 4-нитрофенилфосфат, фотометрические измерения выполняют на длинах волн 405 или 410 нм. В случае применения в качестве метки в конъюгате с антителами пероксидазы, а в качестве субстрата – ортофенилендиамина, измерение оптической плотности проводят при длине волны 492 нм, когда субстратом является тетраметилбензидин (ТМБ), измерения проводят при длине волны 450 нм.
Если фотометр позволяет проводить измерения не только на одной, но и на двух длинах волн, то в качестве второй длины волны при бихроматных измерениях используют длину волны 620-630 нм. Отечественный ридер «УНИПЛАН» (производства ЗАО «ПИКОН») представляет собой малогабаритный вертикальный фотометр для измерения оптической плотности в 96-луночных планшетах. Результаты распечатываются на обычной бумаге формата А4 с указанием даты анализа, фамилии лаборанта, названия учреждения в виде таблицы в форме планшета. Прибор работает и программируется в диалоговом режиме. Он оснащен дисплеем, а программное обеспечение позволяет использовать большой спектр наборов реактивов, так как можно ввести в память прибора и сохранить в ней большое количество формул для расчета результатов. Имеется также звуковая сигнализация для всех режимов. Как и все современные приборы, этот ридер может быть подключен к персональному компьютеру. Установку светофильтров проводят вручную. Прибор позволяет получать качественные результаты по принципу («+», «-»), «оптическая плотность критическая» – «cut-off» и осу-ществляет расчет «серой зоны» для того, чтобы дифференцировать группу положительных реакций (оптическая плотность результата выше значения «cut-off») от группы «неопределенных» – сомнительных результатов, четко обозначить область положительных и отрицательных результатов (рис. 4.10).
Рис. 4.10. Пример графического представления «оптической плотности критической» на анализаторе «УНИПЛАН»
В России выпускается семейство автоматизированных иммуноферментных анализаторов АИФ и комплект для систематического оперативного контроля качества иммуноферментных анализаторов – КПА-01 (ЗАО «ИЛИП»). Этот комплект позволяет проверить стабильность и воспроизводимость результатов во всем диапазоне, идентичность измерений в измерительных каналах, длин волн измерительного светового потока, правильность положения планшета, функционирования ридера в специальных режимах. Он имеет режим градуировки ридера с помощью набора нейтральных светофильтров.
Дозаторы, промыватели, инкубаторы используют и в других лигандных методах (радиоиммунных, люминесцентных, флюоресцентных). Имеются и отличия в оборудовании, особенно в ридерах, предназначенных именно для этих методов. Микропланшеты на 96 ячеек, используемые для измерения поляризации флюоресценции, должны быть черного цвета для исключения интерференции смешанного света отражения (как в белых плашках) и поляризованного света.
