Химическое исследование желудочного содержимого

Для проведения данных исследований рабочее место должно быть оснащено следующими элементами:

1. Набор пробирок, пипеток.
2. Стеклянные капиллярные трубочки.
3. Скальпель.
4. Миллиметровая линейка.
5. Лупа.
6. Водяная баня.
7. Термостат.
8. Секундомер.
9. Фиксанал соляной кислоты.
10. Диметиламидоазобензол.
11. Фенол.
12. Хлорное железо.
13. Едкий натр.
14. Пепсин.
15. Хлористый кальций.
16. Сернокислая медь.
17. Йодистый калий.
18. Кристаллический йод.
19. Ледяная уксусная кислота.
20. Пирамидон.
21. Эфир.
22. Глицерин.
23. Свежее куриное яйцо.
24. Сырое нежирное молоко.
25. Лакмус или универсальная индикаторная бумага.
26. Метилоранж.

Определение дефицита соляной кислоты

Дефицит соляной кислоты определяют в желудочном содержимом, в котором свободная соляная кислота отсутствует. Для этой реакции необходимы следующие реактивы:

• 0,1 N раствор соляной кислоты (готовят из фиксанала соляной кислоты);
• 0,5% спиртовой раствор диметиламидоазобензола.

Техника определения. К 5 или 10 мл профильтрованного желудочного содержимого прибавляют 1-2 капли 0.5% раствора диметиламидоазобензола и титруют 0,1 N раствором соляной кислоты до появления красного окрашивания. Исходный уровень 0,1 N раствора соляной кислоты и уровень по окончании титрования записывают. Производят расчет.

Пример расчета. Исходный уровень 0,1 N раствора соляной кислоты у деления «0». На титрование 5 мл желудочного содержимого израсходовано 2 мл 0,1 N раствора соляной кислоты. Следовательно, на 100 мл израсходуется в 20 раз больше: 2X20 = 40 мл 0,1 N раствора соляной кислоты.

Ответ: дефицит соляной кислоты равен 40. При полном прекращении секреции дефицит соляной кислоты составляет около 20.

Определение молочной кислоты

Небольшое количество молочной кислоты обнаруживают в нормальном желудочном содержимом, взятом после хлебно-водного завтрака, так как хлеб содержит молочную кислоту. Поэтому молочную кислоту рекомендуют определять в желудочном содержимом, взятом натощак при отсутствии в нем свободной соляной кислоты.
Для определения молочной кислоты используют реакцию Уфельмана.

Техника определения молочной кислоты. Принцип реакции основан на том, что соли трехвалентного железа дают с молочной кислотой желто-зеленое окрашивание, обусловленное образованием молочнокислого железа. Для реакции необходим реактив Уфельмана, который состоит из следующих растворов:
1)    2% раствора фенола (карболовой кислоты). 2 г фенола помещают в 100-миллилитровую мерную колбу и доливают дистиллированной водой до метки;
2)    10% раствора хлорного железа (10 г хлорного железа помещают в мерную 100-миллилитровую колбу и доливают дистиллированной водой до метки).

Реактив готовят непосредственно перед постановкой реакции. В пробирку помещают 10 мл 2% раствора фенола, прибавляют по каплям 10% раствор хлорного железа до появления серовато-фиолетового окрашивания.

Постановка реакции. К 5 мл реактива Уфельмана приливают по каплям профильтрованное желудочное содержимое. При наличии молочной кислоты серовато-фиолетовое окрашивание переходит в зеленовато-желтое. Имеющаяся в желудочном содержимом свободная соляная кислота обесцвечивает реактив Уфельмана. По¬этому при наличии свободной соляной кислоты в желудочном содержимом реакцию Уфельмана проводят с эфирной вытяжкой.

Эфирную вытяжку готовят следующим образом: 5 мл профильтрованного желудочного содержимого помещают в небольшую делительную воронку, приливают 20 мл эфира и тщательно взбалтывают. В момент, когда содержимое разделится на слои, в одну пробирку из делительной воронки выливают нижний водный слой, а в другую — эфирный. К полученной эфирной вытяжке прибавляют 20 мл дистиллированной воды и 2 капли 10% раствора хлорного железа. В присутствии молочной кислоты водный слой приобретает зеленоватое или зелевовато-желтое окрашивание. Интенсивность окраски зависит от количества молочной кислоты в желудочном содержимом.

Определение летучих жирных кислот

Техника определения летучих жирных кислот. Органолептически летучие жирные кислоты (масляная, уксусная) определяют по характерному запаху (уксусная кислота пахнет уксусом, масляная — прогорклым маслом).

Химически их определяют следующим образом: 3-5 мл исследуемого желудочного содержимого нагревают в пробирке, после чего в нее вносят полоску увлажненной синей лакмусовой бумажки. В присутствии летучих жирных кислот лакмусовая бумажка краснеет.

Для более точного определения летучих жирных кислот из желудочного содержимого готовят эфирную вытяжку (к 1-2 мл желудочного содержимого приливают 5 мл эфира, смесь встряхивают, после чего дают ей отстояться). В отдельную пробирку наливают 2 мл дистиллированной воды и вносят каплю 1% раствора хлорного железа. На эту смесь наслаивают приготовленную эфирную вытяжку. В присутствии масляной кислоты на границе жидкостей образуется оранжевое кольцо, а при наличии уксусной кислоты — темно-красное.

Определение кровяного пигмента

Для выявления кровяного пигмента требуются следующие реактивы:

• 50% раствор уксусной кислоты: к 50 мл ледяной уксусной кислоты приливают 50 мл дистиллированной воды.
• 5% раствор пирамидона в 96° этиловом спирте.
• 3% раствор перекиси водорода.

Техника определения кровяного пигмента (проба Тевенона и Ролланда). К 1 мл желудочного содержимого прибавляют 16 капель 50% раствора уксусной кислоты. Затем осторожно, по стенке, наслаивают смесь из 1 мл 5% раствора пирамидона и 12 капель 3% раствора перекиси водорода. В присутствии кровяного пигмента на границе жидкостей получается сине-фиолетовое кольцо.

Примечание. При наличии кровянисто окрашенных слизистых клочков или мелких кровяных сгустков, отобранных для микроскопического исследования, реакция на кровяной пигмент с общей массой желудочного содержимого может дать отрицательный результат. В таких случаях отмечают наличие крови в клочках слизи или в сгустках.

Определение пепсина

Количественное определение пепсина по способу Метта. Приготовляют тонко-стенные стеклянные трубочки с просветом от 0,5 до 1 мм и около 2 см длиной. Моют и сушат их, после чего заполняют профильтрованным яичным белком (смешивают белок из нескольких яиц и фильтруют сквозь тряпочку; при наличии в белке пузырьков воздуха его ставят на несколько часов в эксикатор). Заполнение трубочек производят путем насасывания белка, после чего один конец трубочки залепляют. Таким путем заполняют все приготовленные трубочки, которые выдерживают в горизонтальном положении в воде при температуре 85° до полного свертывания белка.

После остывания воды трубочку со свернувшимся белком вынимают, обмывают водой и хранят в глицерине или воде, насыщенной хлороформом.

Для определения активности пепсина в пробирку наливают исследуемый желудочный сок, в него помещают четыре приготовленные трубочки со свернувшимся белком (палочка Метта) и ставят в термостат при температуре 37-38°. При отсутствии соляной кислоты желудочный сок предварительно подкисляют.

Через 24 часа трубочки извлекают и с помощью миллиметровой линейки и лупы измеряют длину переваренного белкового столбика с каждой стороны трубочек. Так определяют активность пепсина. Высчитывают среднюю величину из восьми измерений. Прямой пропорциональности между количеством пепсина и длиной растворенного столбика нет. По правилу Шюца-Борисова количество фермента пропорционально квадрату длины столбика переваренного белка. Если в среднем было переварено 1,5 мм белкового столбика, то пептическая активность желудочного сока 1,5 X 1,5 = 2,25. В норме через 2 часа среднее арифметическое из восьми измерений равно 1,2—1,5 мм.

Определение переваривающей способности желудочного сока по свертыванию молока

Для реакции требуются следующие реактивы:

• 0,5% раствор NaOH: 0,5 г едкого натра растворяют в колбочке в 60—70 мл дистиллированной воды, переносят раствор в мерный цилиндр и доводят дистиллированной водой до метки 100 мл.
• 2% раствор хлористого кальция: 2 г гранулированного хлористого кальция растворяют в 70-80 мл дистиллированной воды, переносят раствор в цилиндр на 100 мл и доливают водой до метки.

1. Качественное определение пепсина. К 10 мл свежего молока прибавляют 2 мл профильтрованного желудочного содержимого, нейтрализованного 0,5% раствором NaOH. Смесь помещают в водяную баню при температуре около 40°. В присутствии пепсина молоко свертывается через 10-30 минут.

2. Количественное определение пепсина. В штатив помещают семь пробирок. В первую наливают 9 мл, а в остальные — по 5 мл дистиллированной воды. Затем в первую пробирку наливают 1 мл профильтрованного желудочного содержимого и смесь перемешивают. 5 мл смеси переносят во вторую пробирку, из второй — в третью и т. д. до шестой пробирки включительно. Из шестой пробирки 5 мл смеси переливают в отдельную пробирку (но не в седьмую — седьмая пробирка содержит только воду). Получают разведения: в первой пробирке в 10 раз, во второй — в 20 раз, в третьей — в 40 раз, в четвертой — в 80 раз, в пятой — в 160 раз, в шестой — в 320 раз. Во все пробирки, включая седьмую, прибавляют по 5 мл свежепрокипяченного (но не горячего!) молока и по 2,5 мл 2% раствора хлористого кальция. Штатив с пробирками встряхивают и ставят в водяную баню при температуре 38-40°. Через 20 минут результат учитывают: определяют, при каком разведении получилось свертывание молока. При нормальном содержании пепсина молоко свертывается во всех пробирках, кроме седьмой, в которой нет желудочного содержимого. При наличии свертывания в седьмой пробирке опыт готовят с более свежим молоком. При уменьшении количества пепсина свертывание в этих пробирках не наблюдается. Полное отсутствие пепсина имеет место, если в пробирке с разведением 1:20 не наступает свертывания.

Определение уропепсина

Способ определения уропепсина основан на установлении времени створаживания казеина молока при рН 4,9.
Для исследования требуются следующие реактивы:

1. 2 N раствор соляной кислоты: в мерную полулитровую колбу наливают 82,4 мл соляной кислоты (удельного веса 1,19) и 300-350 мл дистиллированной воды, содержимое колбы смешивают и доливают до метки дистиллированной водой.
2. 0,2% водный раствор метилоранжа: 0,2 г метилоранжа помещают в цилиндр емкостью 100 мл, растворяют в 50-60 мл дистиллированной воды, а затем доливают водой до метки.
3. Ацетатный буфер: в цилиндр емкостью 100 мл помещают 4,2 г едкого натра и растворяют в 50-60 мл дистиллированной воды, приливают 9,2 мл ледяной уксусной кислоты и доливают водой до метки.
4. Молочно-ацетатная смесь: сырое нежирное молоко и ацетатный буфер смешивают в равных объемах. В холодильнике смесь сохраняется в течение 4-5 дней.
5. Стандартный раствор пепсина в соляной кислоте: 100 мл 3% раствора соляной кислоты и 2 г пепсина.

Для исследования доставляют порцию мочи, выделенную при втором утреннем мочеиспускании. Количество мочи записывают. В направлений должно быть указано время в часах между первым и вторым утренним мочеиспусканием.

Техника определения. В пробирку точно отмеряют 3,8 мл мочи, прибавляют 0,2 мл 2 N раствора соляной кислоты и 1—2 капли 0,2% водного раствора метилоранжа. При рН 3 содержимое пробирки краснеет. Для превращения уропепсиногена в уропепсин пробирку помещают на один час в термостат при температуре 37°. Через один час в две пробирки разливают по 0,1 мл, а в случаях, когда предполагается малое количество уронепсина, по 0,3-0,4 мл подкисленной мочи, по 1 мл ацетатного буферного раствора рН 4,9 и до 2 мл добавляют дистиллированной воды. Все растворы перед прибавлением молока также нагревают до 37°. В пробирки добавляют по 0,5 мл смеси молока с ацетатным буфером. Секундомером засекают время добавления молока и выпадения хлопьев. Реакция должна идти при 37°.

Определяют скорость створаживания молока по стандартному раствору пепсина: к 0,1 мл раствора пепсина быстро прибавляют 5 мл молочно-ацетатной смеси. Молоко считается пригодным к реакции, если створаживание происходит за 40-45 секунд.

Определение перевариваемости белков (биуретовая проба)

Для реакции необходим 10% раствор сернокислой меди: 15 г химически чистой сернокислой меди растворяют в дистиллированной воде, доводя количество раствора до 100 мл.

Постановка реакции. К 5 мл профильтрованного желудочного содержимого прибавляют 5 капель 20% раствора едкого кали и по каплям 10% раствор сернокислой меди до появления окрашивания. В присутствии альбумоз   получается фиолетовое, а в присутствии пептонов   — розоватое или красно-оранжевое окрашивание.

Определение перевариваемости углеводов

Ход определения. К 5 мл профильтрованного желудочного содержимого осторожно приливают 1-2 капли раствора Люголя. При резко повышенной кислотности появляется фиолетовое окрашивание (амидулип), при нормальной кислотности — красное (эритродекстрнн), а при отсутствии свободной соляной кислоты смесь не изменяет цвета (ахродекстрин, мальтоза).