Гормональная диагностика беременности

09.11.2011 5217 0.0 0

Методы гормональной диагностики беременности основаны на обнаружении в моче женщины, у которой подозревается беременность, хорионического гонадотропина (ХГ). Для этой цели предложены различные тест-объекты: мыши, крысы, крольчихи, лягушки.

По степени выраженности изменений, которые наступают в яичниках животных под влиянием введенного ХГ, различают 3 вида реакций: 1-я реакция характеризуется наличием зреющих фолликулов со скоплением гранулезных клеток вокруг яйцеклетки. При 2-й реакции в фолликулах образуются кровоизлияния (кровяные точки). Для 3-й реакции характерно образование в яичниках желтых тел. 1-я реакция не специфична для беременности, так как она бывает положительной при наличии повышенного количества фолликулостимулирующего гормона гипофиза, когда функция яичников угнетена или полностью выключена, как например, в менопаузе. При наличии беременности должны быть положительными 2-я и 3-я реакции.

Гормональная диагностика беременности

Наиболее распространенными являются реакция Ашгейма – Цондека на неполовозрелых самках мышей, на взрослых самках мышей, реакция Фридмана на взрослых крольчихах и сперматозоидная реакция Галли-Майнини на самцах-лягушках или жабах.

Реакция Ашгейма – Цондека

Сущность реакции заключается в том, что введенная под кожу неполовозрелым самкам белых мышей моча беременной вызывает у них изменения в половом аппарате, соответствующие 2-й и 3-й реакциям. Моча небеременной женщины таких изменений не вызывает или же в крайнем случае может наступить только 1-я реакция.

Для выполнения реакции берут утреннюю, предварительно профильтрованную мочу; если она щелочной или нейтральной реакции, то ее подкисляют уксусной кислотой. Учитывая, что мочу вводят мышам в течение 3 сут, добавляют трикрезол из расчета 1 капля на 25–30 мл мочи. До конца исследования мочу сохраняют в холодильнике. Опыт проводят не менее как на 5 инфантильных самках белых мышей, так как примерно 15% мышей в ходе опыта погибают из-за токсичности мочи. Кроме того, не все мыши одинаково реагируют на введение мочи. Так, например, положительную реакцию иногда отмечают у 1–2 из 5 мышей. Мыши должны иметь вес 6–8 г и быть не моложе 3 нед и не старше 5 нед. Более молодые мыши мало чувствительны к гонадотропину и, кроме того, они хуже переносят введение мочи. У более взрослых мышей созревание фолликулов и образование желтых тел может происходить в результате воз-Действия гонадотропинов их собственного гипофиза. Инъекции мочи производят 3 раза в день в течение 2 дней, причем мыши получают разное количество мочи (0,2; 0,25; 0,3; 0,4; 0,5 мл). Таким образом, за б инъекций Доза исследуемой мочи составляет соответственно 1,2;  1,5; 1,8; 2,4; 3,0 мл. Некоторые авторы вводят мочу 2 раза в день по 0,5 мл в течение 3 дней (Е. И. Кватер).

Через 96–100 ч животных убивают эфиром или же обезглавливают и вскрывают брюшную полость. При положительной реакции изменения в яичниках легко обнаружить невооруженным глазом или при помощи лупы. В неясных случаях рекомендуют вырезать яичники, промыть их водой и положить на предметное стекло в каплю глицерина. Через 10–15 мин яичники становятся бледными и на этом фоне кровяные точки выступают особенно ярко. По данным К. М. Фигурнова (1935), в 10% случаев для решения вопроса приходится прибегать к микроскопическому исследованию. Реакция Ашгейма – Цондека дает правильный ответ в 98%. После удаления плодного яйца из организма реакция может быть положительной еще в течение 8–10 дней.

Диагностика беременности на взрослых мышах (реакция Эскина и Фрейдовича)

По этой методике испытуемую мочу вводят однократно в количестве 1 мл взрослым самкам белых мышей весом 18– 20 г. Опыт проводят на 5 мышах. Через 48 ч мышей забивают и исследуют яичники на содержание в них кровяных точек. Реакция считается положительной, если у 3 из 5 мышей в фолликулах яичника обнаруживаются отчетливые кровяные точки. По данным авторов, точность диагностики беременности на взрослых мышах не уступает реакции на инфантильных мышах. Она имеет то преимущество, что ответ получают спустя 48 ч, а не через 96–100 ч, как при использовании инфантильных животных. Кроме того, однократное введение мочи значительно упрощает проведение реакции.

Реакция Фридмана

В качестве биологического теста для диагностики беременности используют половозрелых крольчих. У них не происходит спонтанного лопания созревших фолликулов и образования желтых тел. Эти процессы совершаются только после покрытия крольчих самцом в результате рефлекторного возбуждения передней доли гипофиза и выделения гонадотропных гормонов. После гипофизэктомии, произведенной в первые часы после спаривания, лопания фолликулов не происходит. Введение в ушную вену крольчихи 24 мл мочи беременной женщины в течение 2 сут (по 4 мл 6 раз) приводит через 48 ч к кровоизлияниям в фолликулах и началу образования желтых тел.

Наиболее пригодными для опытов считают крольчих весом 1200–1800 г. Их относят к «созревающим» животным. Половозрелыми являются крольчихи весом от 1800 до 2000 г, вполне зрелыми – от 2000 г и больше. Опыт проводится на самках, содержащихся отдельно от самцов. Для реакции берут утреннюю мочу, профильтровывают ее и вводят в ушную вену крольчихи в количестве 10–20 мл. Вводить мочу нужно медленно. Можно вводить ее и дробными порциями по 4 мл 3 раза в день в течение 2 дней. Некоторые авторы рекомендуют применять не внутривенные, а подкожные инъекции однократно 25–30 мл (К. М. Фигурнов, 1935). Такой метод введения мочи на точности реакции не отражается, а преимущества его очевидны: он не приводит к гибели животных вследствие токсического действия мочи, к тому же технически легче выполним. Через 48 ч после инъекции крольчиху под эфирным наркозом, соблюдая правила асептики и антисептики, подвергают чревосечению: делают продольный разрез брюшной стенки по средней линии и производят осмотр яичников. В случае положительной реакции в них обнаруживают такие же изменения, как у мышей, но они выражены более отчетливо. На поверхности яичника выпячиваются крупные фолликулы с кровоизлияниями в них, окрашенные в темно-вишневый цвет.

Одну и ту же крольчиху можно использовать в опыте 5–6 раз (в случае отрицательной реакции очередной опыт проводят через 1,5–2 нед, при положительной реакции – не раньше чем через 1 мес). Реакция Фридмана дает правильный ответ в 98–99%  случаев.

Диагностика беременности на лягушках-самцах

Широкое распространение получила биологическая проба на беременность, которую проводят на лягушках-самцах. Гонадотропные гормоны гипофиза оказывают влияние на половые железы особей обоего пола. На половой аппарат самцов-лягушек гипофизарные гонадотропины и ХГ действуют идентично, вызывая выделение сперматозоидов в клоаку. На этом принципе и основана реакция Галли-Майнини. Постановка реакции обходится очень дешево, так как лягушки не требуют специального ухода. Их содержат в прохладном полутемном помещении в посуде с небольшим количеством воды, которая должна стоять под небольшим углом, чтобы часть дна не была покрыта водой. Воду нужно менять ежедневно. В таких условиях лягушки могут долго жить без пищи. За несколько часов до постановки опыта лягушек нужно принести в помещение, где будет проводиться реакция, чтобы они адаптировались к температуре помещения.

Из лягушек, обитающих в Советском Союзе, наиболее чувствительны к ХГ озерные лягушки (Rana ridibunda), затем – зеленые (Bufo viridis) и обыкновенные жабы (Bufo bufo), наименее чувствительны прудовые лягушки (Rana esculenta). Наиболее часто для постановки реакции используют озерных лягушек, которые проявляют реактивность к ХГ на протяжении целого года. Для опыта берут половозрелых самцов весом от 50 до 75 г и длиной 6–7,5 см. Самцы отличаются от самок тем, что у них на первом пальце передних лап имеется большая мозоль.

Реакцию ставят на 2 лягушках. Предварительно исследуют содержимое клоаки на наличие сперматозоидов. Для этого глазной пипеткой набирают из клоаки каплю жидкости, наносят ее на предметное стекло и рассматривают под микроскопом. В случае обнаружения сперматозоидов лягушку из опыта исключают.

Свежую утреннюю мочу в количестве 3–5 мл впрыскивают в лимфатический мешок, расположенный под кожей спины. Через 2 ч фиксируют результат. Если реакция положительная, в клоаке обнаруживают сперматозоиды. Их рассматривают под микроскопом при малом увеличении в слегка затененном поле зрения. Реакция считается положительной, если сперматозоидов много и большая часть их подвижна. Если количество сперматозоидов невелико (2–5), реакцию необходимо повторить.

Лягушек можно многократно использовать для реакции, однако если животное реагировало положительно 5–6 раз, чувствительность к ХГ у него постепенно снижается. В случае положительной реакции эту лягушку можно использовать в следующем опыте не раньше, чем через неделю; при отрицательном результате – через 2–3 дня.

Реакция на лягушках-самцах выгодно отличается от других биологических проб быстротой и простотой техники, может быть произведена в любой обстановке, доступна каждому практическому врачу.

Реакцию Галли-Майнини широко применяют не только для диагностики нормальной беременности. Ею пользуются при подозрении на пузырный занос или хорионэпителиому. При пузырном заносе реакция резко выражена и наступает очень быстро – через 15–20 мин. В таких случаях необходимо произвести количественное определение ХГ. При нормальной беременности определяется положительная реакция при введении лягушке цельной мочи или если моча разведена не больше, чем в 2–5 раз. При пузырном заносе реакция сохраняется положительной при разведении мочи в 10, 20 раз и больше. При хорионэпителиоме выделяется огромное количество ХГ и реакция может оказаться положительной даже при разведении мочи в 100 раз.

В свое время Б. Цондек предложил определять содержание гонадотропного гормона путем разведения мочи и соответствующих вычислений на мышах, А. Э. Мандельштам – на крольчихах.

При постановке реакции на лягушках-самцах также возникла необходимость в количественном определении ХГ. Наименьшее количество мочи, которое вызывает через 2 ч после инъекции выход сперматозоидов в клоаку у озерной лягушки весом 45– 50 г, получило название лягушачьей единицы (л. е.). Для определения количества ХГ в 1 л исследуемой мочи удобно пользоваться шкалой, предложенной А. А. Давиденко  (табл. 1).

Шкала для вычисления хорионического гонадотропина в моче

При хорионэпителиоме ХГ нередко приобретает новое качество: он из термолабильного становится термостабильным. Поэтому реакцию проводят после кипячения мочи в течение 15 мин. Согласно данным И. П. Гоменюка (1971), при сохранении в течение длительного времени положительной биологической реакции на ХГ после удаления пузырного заноса, решающим в диагностике хорионэпителиомы является не столько повышение титра гонадотропина, сколько переход ставшей было отрицательной реакции в положительную или превращение термолабильного гонадотропина в термостабильный.

Говоря о том, что при физиологической беременности ХГ является термолабильным и только в патологических условиях превращается в термостабильный, имеют в виду непереносимость им высоких температур. Испытание устойчивости ХГ к низким температурам проводил И. И. Усоскин. Мочу беременных подвергали замораживанию и хранению при температуре – 12° в течение различных промежутков времени (от 5 нед до 2 мес). При этом во всех случаях выявлена термостабильность ХГ.

Достижения в области иммунологии позволили разработать новый метод диагностики беременности, основанный на том, что ХГ, являясь веществом белковой природы, обладает выраженными антигенными свойствами. Эти свойства были описаны еще Б. Цондеком, однако ввиду отсутствия   очищенных   препаратов ХГ, высокочувствительных серологических реакций, недостаточно разработанной методики иммунизации животных они не могли быть доказаны.

В настоящее время, благодаря усовершенствованию указанных методик и наличию очищенных препаратов ХГ, установлено, что при парентеральном введении животным ХГ, выделенного из мочи беременных женщин, в крови появляются специфические антитела. Получены иммунные сыворотки с высоким титром специфических антител, содержащих агглютинирующие, преципитирующие и комплементсвязывающие антитела. В соответствии с указанными свойствами антител для определения ХГ предложены реакции:

  • торможения гемагглютинации;
  • преципитации;
  • связывания комплемента;
  • задержки осаждения частичек латекса.

Наибольшее распространение получила реакция торможения агглютинации, предложенная в 1960 г. Wide и Gemzell. Она основана на том, что ХГ, содержащийся в моче беременных женщин, тормозит реакцию агглютинации эритроцитов, на поверхности которых адсорбирован ХГ, соответствующей антисывороткой. Для получения антисыворотки против ХГ иммунизируют кроликов одним из препаратов ХГ (хориогонин фирмы Гедеон Рихтер, ХГ отечественного производства, гонабион – ГДР и др.). Антигеном служат специально обработанные эритроциты барана, «заряженные» одним из указанных препаратов.

Реакция торможения гемагглютинации заключается в следующем: кроличья антисыворотка, содержащая антитела против ХГ, агглютинирует специально обработанные эритроциты барана, на поверхности которых абсорбирован ХГ. Если такую антисыворотку сначала инкубировать с мочой, содержащей этот гормон или с раствором гонадотропина и после этого прибавить к ней сенсибилизированные эритроциты барана, то реакция агглютинации не наступает вследствие истощения антител в антисыворотке, и эритроциты оседают в виде четкого кольца на дне пробирки или лунки специальной матрицы, которую используют для постановки данной реакции. Отсутствие агглютинации при этих условиях свидетельствует о наличии ХГ в испытуемой моче, то есть подтверждается диагноз беременности. Выполнение реакции занимает 1–2 ч.

Для повышения иммунореактивных свойств организма животного и антигенных свойств препарата, содержащего ХГ, применяют адъюванты. Наиболее эффективным является адъювант Фрейнда (ланолин 20 мл, вазелиновое масло 40 мл, убитые туберкулезные бактерии 30 мг).

С. М. Мартынов и Б. П. Стернюк (1965) предложили упрощенную методику определения ХГ в моче при помощи реакции гемагглютинации.

Стекло помещают в увлажненную чашку Петри при комнатной температуре. Учет реакции производят под микроскопом. При наличии в исследуемой моче ХГ агглютинация эритроцитов отсутствует, и наоборот, если он не содержится, наступает агглютинация.

Реакция торможения гемагглютинации более чувствительна, чем реакция Галли-Майнини, и позволяет выявлять очень ранние сроки беременности. Многие авторы, сравнивая данные, полученные при использовании иммунологического метода и наиболее точных биологических реакций (Ашгейма – Цондека, Фридмана, Галли-Майнини), пришли к выводу, что результаты иммунологических реакций не только равноценны, но по своей точности могут превосходить таковые, полученные при помощи биологических тестов. Точность метода при наличии ХГ в моче составляет 98–99°. В настоящее время для проведения иммунологических реакций выпускают готовые реагенты в лиофилизированной форме (гравимун, прегностикон, тела Орто и др.).

Гравимунтест

Широко применяют гравимунтест. Набор необходимых для проведения реакции ингредиентов выпускают в СССР и в ГДР под названием «Гравимунтест».

Как любой иммунологический метод, гравимун-тест основан на торможении реакции агглютинации между «заряженными» ХГ эритроцитами, антисывороткой и мочой беременной женщины.

При наличии значительного количества ХГ в исследуемой моче, гормон связывается с антисывороткой, а эритроциты оседают на дно пробирки в виде кольца или кнопки. Если исследуемая моча содержит малое количество ХГ или последний вообще отсутствует, эритроциты не оседают, а распределяются в растворе равномерно. Точность гравимун-теста довольно высокая: чувствительность реакции проявляется при наличии около 2500 ME ХГ в 1 л мочи. Такое количество гормона обычно имеется в моче на 8–10-й день задержки менструации.

Ампула гравимуна содержит лиофилизированную антисыворотку и «заряженные» ХГ эритроциты. В коробке с набором «Гравимун» имеется 5 запаянных ампул, что позволяет одновременно производить 5 исследований. К каждой ампуле приложен капилляр, которым набирают необходимое количество исследуемой мочи. Кроме 5 ампул, имеется флакон с раствором натрий-хлорид-фосфатного буфера.

Постановка реакции:

  1. Ампулу открывают напильником и к содержимому прибавляют 0,4 мл буфера.
  2. Немедленно в ту же ампулу капилляром добавляют 2 капли обязательно свежей утренней профильтрованной мочи.
  3. Содержимое ампулы перемешивают, после чего оставляют ее в коробке на 2 ч при комнатной температуре.
  4. Через 2 ч фиксируют результат. Если эритроциты осели на дно ампулы в виде кольца или кнопки, то есть не произошло агглютинации, результат реакции оценивают как положительный. Если эритроциты распределились диффузно, – результат отрицательный.

Реакция остается положительной до тех пор, пока ворсины хориона сохраняют связь с материнским кровотоком, что имеет место при неполных абортах и нарушенной внематочной беременности.

Необходимо помнить, что все реакции определения ХГ с целью ранней диагностики беременности дополняют клинические наблюдения. Поэтому следует учитывать клинические и лабораторные данные. Иногда имеют место ложноположительные результаты: при повышении количества гонадотропинов в климактерическом  периоде,  опухолях гипофиза,  гормонотерапии.


Читайте также:
Комментарии
Имя *:
Email *:
Код *: