Применение диагностических полосок для общеклинического анализа мочи

Техника анализа

Эти полоски используют для массового «ситевого» (от слова «просеивание», т.е. пропускание через скрининговое «сито») исследования большого числа образцов мочи. На рис. 7.1 изображены схема диагностической полоски «Combur 10 Test» и устройство одной из зон – для обнаружения крови (гемоглобина) в моче.

Рис. 7.1. Схема устройства диагностической тест-полоски для исследования мочи «Combur 10 Test» (а) и тестовое поле для обнаружения гемоглобина (б) в разрезе: 1 – нейлоновая сетка; 2 – сетчатый слой, содержащий йод; 3 – бумага с реагентом; 4 – абсорбирующая бумага; 5 – подложка

Если на полоске объединены несколько реакционных зон, содержащих реагенты для анализа различных аналитов, их наклеивают на общую полимерную подложку. Бумажная подложка, содержащая абсорбент, предотвращает интерференцию и удаляет избыток мочи. Чувствительная реакционная зона защищена от контакта, загрязнений и царапин специальной нейлоновой сеткой, которая также обеспечивает быстрое и однородное проникновение мочи и равномерное развитие окраски реакционной зоны, что существенно повышает аналитическую надежность полоски.

В целях предотвращения влияния интерференции содержащейся в моче аскорбиновой кислоты в полоске, верхний слой зоны для определения гемоглобина импрегнируется йодатом, который окисляет аскорбиновую кислоту Чтобы избежать воздействия влаги на реагенты тест-полосок, контейнеры для их хранения оснащают осушителем, который располагают в крышке контейнера или пенала.

Некоторые аналиты мочи при отсутствии патологии имеют значения, близкие к нулю. Для них важной характеристикой является порог обнаружения (чувствительность метода). В основе методов «сухой химии» для анализа мочи лежат цветные реакции, приводящие к изменению окраски тестовой зоны полоски. В зависимости от химических свойств определяемого аналита используют как обычные химические реакции, так и ферментативные (например, глюкозооксидазная реакция для анализа глюкозы в моче, или количества лейкоцитов в моче на основе исследования активности их собственной эстеразы).

Результат с диагностической полоски может считываться визуально, изменение окраски тестовой зоны сопоставляется с цветной шкалой, обычно нанесенной на пенал, в котором хранятся полоски. При этом важно, чтобы диагностически значимые изменения показателя мочи вызывали визуально заметные изменения окраски. Для объективизации измерения изменения окраски полоски используют отражательные фотометры — анализаторы мочи. Анализ может быть автоматизирован.

Полоски для исследования одного аналита называются монотестами, или монофункциональными (например, полоски «УРИБЕЛ» отечественного предприятия «Биосенсор АН» или «альбуФАН» фирмы «PLIVA-Lachema a.s.», Чехия) предназначены для исследования альбумина в моче, «глюкоФАН» – глюкозы. Полоски для одновременного анализа нескольких аналитов называются политестами, или полифункциональными. Различают специальные полоски целевого назначения для выявления определенного вида функциональных нарушений или заболеваний, например «КЕТОГЛЮК-1», «диаФАН» – полоски с двумя тестовыми зонами для исследования кетонов и глюкозы, для выявления сахарного диабета, «иктоФАН» — с тестовыми зонами на билирубин и уробилиноген для выявления гепатитов и других заболеваний печени и желчных путей, заболеваний крови; «нефроФАН» – для исследования мочи на эритроциты, белок, нитритобразующие бактерии и pH для диагностики заболеваний почек.

Концентрация реактивов в тестовых зонах подобрана таким образом, чтобы как можно быстрее получить результат, в течение 40-60 с. Лишь при анализе лейкоцитов время реакции на некоторых тест-полосках удлиняется до 120 с. Отечественное предприятие«Биосенсор АН» выпускает тест-полоски для обнаружения в моче одного или двух аналитов. Политесты поставляют различные зарубежные фирмы. Максимальное количество тестовых зон на одной полоске - 11.

Химические принципы, лежащие в основе реакций на полосках различных изготовителей для одного и того же аналита близки, хотя существуют отличия в составе реактивов, что влияет и на различие окраски тестовой зоны, чувствительность и подверженность ее воздействию различных факторов, что, как правило, подробно описано в инструкциях к тест-полоскам.

Определение глюкозы

Для обнаружения глюкозы используют ферментативный, высокоспецифичный для D-глюкозы глюкозо- оксидазный метод. Образующийся в ходе гидролиза глюкозы пероксид водорода в реакции, катализируемой пероксидазой, участвует в окислении индикатора – хромогена. Им может быть в зависимости от изготовителя о-толидин, йодат натрия, тетраме-тилбензидин, 4-аминофеназон и др. Соответственно и окраска тестовой зоны изменяется от зеленой до синей и коричневой или может приобретать различные оттенки пурпурного цвета, что указано на шкале упаковки полосок. Чувствительность этих тестов также различна, минимальная обнаруживаемая концентрация – от 0,495 ммоль/л, как в полосках «Phan», до 4-7 ммоль/л – в полосках «Multistix». Диапазон обнаружения глюкозы в моче очень широк: до 55-111 ммоль/л.

Обнаружение белка

Все известные тесты обнаружения белка основаны на принципе, получившем название «белковой ошибки», или «белковой обманки индикатора», когда в присутствии кислотно-основного индикатора (как правило, тетрабромфенолового синего одного или в сочетании с тетрабромфенолфталеином) окраска индикатора в зависимости от содержания белка в моче меняется от желтого до зеленого и синего цвета. Тест высокочувствителен к альбумину и реагирует на его присутствие в моче в концентрации 0,1 –0,15 г/л. В большинстве тестов диапазон обнаружения – до 10 г/л.

Определение билирубина

Метод обнаружения билирубина основан на реакции прямореагирующего конъюгированного билирубина с диазотированными фенольными соединениями (триазеном, диазотированным 2,4-дихлоранилином, диазотированным 2-метил-5-нитроанилином и др.) с образованием продуктов, окрашенных в различные оттенки розового цвета. Реакция высокоспецифична для конъюгированного билирубина. В зависимости от теста чувствительность – от 4,3 до 8,5 мкмоль/л, диапазон обнаружения до 50-100 мкмоль/л.

Определение уробилиногена

Для определения уробилиногена существуют две группы тестов: тест-полоски, в основе действия которых лежат реакции с солями диазония в кислой среде с образованием продуктов, окрашенных в различные оттенки до красного цвета; другой тип – реакция Эрлиха. Реакция с солями диазония более специфична в отношении уробилиногена, чем реакция Эрлиха. Чувствительность у разных тестов колеблется от 6,0 до 35,0 мкмоль/л, диапазон обнаружения – до 200 мкмоль/л.

Определение эритроцитов

Благодаря пероксидазной активности гемоглобин и миоглобин катализируют окисление индикатора (о-толидина, тетраметилбензидина) органической гидроперекисью – кумен гидроксипероксидом. Гомогенная (от зеленой до синей) окраска характерна для гемоглобина (гемолизированные эритроциты); негемолизированные эритроциты обнаруживаются в виде сине-зеленых точек. Тест специфичен для гемоглобина и миоглобина. Чувствительность – 5-20 эритроцитов на 1 мкл 0,15-0,3 мг/л гемоглобина. Тестовые зоны, как правило, более чувствительны к гемоглобину, чем к цельным эритроцитам. Диапазон обнаружения – до 250 эритроцитов на 1 мкл или до 10 мг/л гемоглобина.

Определение нитритов

Тесты на нитриты основаны на реакции Гризза: нитриты, образующиеся в результате деятельности нитратредуцирующих бактерий (Klebsiella, E.coli, Proteus, Aerobacter и др.) под действием нйтратредуктазы, взаимодействуют с сульфаниламидом (например, шарсаниловой кислотой), иммобилизованным в тестовой зоне, с образованием соли диазония.

В последующей реакции азосочетания этого диазосоединения с N-1-нафтилэтилендиаминдигидрохлоридом или тетрагидробензохинолином образуется соединение – азокраситель, окрашивающее желтую тестовую зону в различные оттенки от розового до красного цвета. Тест не является показателем бактериурии, вызванной другими микроорганизмами.

Нижний предел обнаружения количества образующихся нитритов соответствует 0,5-1,0 мг/л нитратов, или количеству микробов 100000 на 1 мл мочи. Обычное количество – 10000 бактерий на 1 мл мочи – не вызывает изменения окраски тестовой зоны. Появление гомогенной розовой окраски любой интенсивности свидетельствует о бактериурии, вызванной нитратредуирующими бактериями.

Выразить результаты полуколичественно не представляется возможным, поскольку концентрация образующихся нитритов не отражает степень инфицирования мочеполового тракта. Отринь тельный результат не свидетельствует об отсутствии бактерий в некоторых тестах, например полосках «CYBOW», цветовая шкала которых рассчитана до верхнего предела 30,0 мг/л нитратов.

Определение PH мочи

Для оценки pH мочи используют смешанный кислотно-основной индикатор (фенолфталеин в сочетании с боомтимоловым синим). Он изменяет цвет в переходном диапазоне от желтого (pH 5,0) до бирюзового (pH 9,0). Нижний предел оценки 0,5-1,0 ед. pH.

Определение относительной плотности

Тестовая зона полоски для оценки относительной плотности мочи содержит детергент и индикатор бромтимоловый синий, реагирующий на присутствие ионов и, следовательно, осмоляльность мочи. В присутствии катионов протоны освобождаются агентом, образующим комплексы с ними, и окраска индикатора бромтимолового синего меняется от голубого через зелено-голубой до желтого. В некоторых полосках индикаторная зона пропитывается еще и окрашенным в красный цвет красителем, в конечном итоге в этих случаях тестовая зона окрашивается в зависимости от концентрации электролитов в моче в темно-синий, пурпурный и красно-коричневый цвет. Чувствительность – 0,005 ед., диапазон обнаружения – от 1,000 до 1,030.

Определение лейкоцитов

Принцип обнаружения лейкоцитов основан на способности эстеразы лейкоцитов, локализующейся в цитоплазме, в основном в лизосомах сегментоядерных нейтрофилов, расщеплять эфйр индоксила, иммобилизованный в тестовой зоне. Свободный индоксил взаимодействует с диазониевой солью с образованием соединения, окрашенного в различные оттенки фиолетового цвета. Метод специфичен для нейтрофилов и в зависимости от теста позволяет обнаруживать от 10 до 25 лейкоцитов на 1 мкл мочи. Пределы обнаружения – от отрицательной реакции приблизительно до 500 лейкоцитов на 1 мкл.

Определение аскорбиновой кислоты

Некоторые диагностические полоски имеют тестовые зоны, позволяющие обнаруживать аскорбиновую кислоту (например, полоски «ФАН», «Урискан»). Реакция основана на использовании аскорбиновой кислоты как восстановителя, например, при обесцвечивании реактива Тилльманна: в присутствии аскорбиновой кислоты иммобилизованный в тестовой зоне 2,6-дихлорфенолиндофенол восстанавливается, и окраска зоны изменяется от серо-голубой до оранжевой (полоски «Лабстрип У»). В полосках «ФАН» аскорбиновая кислота восстанавливает фосфорную кислоту и образуется молибденовый синий. Чувствительность – 0,18-0,3 ммоль/л, диапазон обнаружения – до 3,4 ммоль/л.

Выполнение анализа и оценка результатов исследования

Визуальная оценка результатов по цветным шкалам, нанесенным на контейнеры для хранения полосок, а также при полуколичественном определении на отражательных фотометрах может быть выражена как в единицах концентрации, так и в виде градации результатов: отрицательные – «-», сомнительные – «±», положительные – «+»> «++», «+++», а для некоторых компонентов (белок, глюкоза, относительная плотность, уробилиноген) – «++++». Учитывая, что некоторые полоски могут быть исполь ваны не только для визуальной оценки, но и для полуколичественного определения указанных компонентов на отражательных фотометрах для мочи, в них предусмотрены так называемые компенсационные зоны. Последние не импрегнированы и представляют собой своего рода «холостые пробы», постановка которых необходима для приборной компенсации нативного окрашивания мочи при обнаружении некоторых компонентов.

При практическом выполнении тестов на диагностических полосках для мочи следует внимательно изучить инструкцию и проводить анализ в соответствии с правилами, изложенными в ней:

1. Для исследования используют свежесобранную мочу, хранившуюся до анализа не более двух часов.
2. Мочу тщательно перемешивают, не центрифугируют.
3. Далее нужно изъять из пенала, не прикасаясь руками к тестовым зонам, необходимое для анализа количество полосок. Пенал следует быстро закрыть крышкой.
4. Держа полоску за конец, свободный от тестовых зон, плавно погрузить полоску в пробирку или другой сосуд с мочой, не делая резких и перемешивающих движений, что может приводить к вымыванию реагентов из тестовых зон. Включить секундомер.
5. Спустя 1–2 с (время указано в инструкции) полоску извлекают из мочи, ребром полоски касаясь сосуда, в котором она находится, удаляют избыток мочи. Этой операции следует уделять особое внимание. Лишнее количество мочи в виде капли на тестовой зоне может привести к завышенным результатам. Присутствие мочи в промежутках между зонами вызывает смешивание реагентов соседних зон, что вызывает нарушение протекания реакций и ошибочные результаты.
6. После удаления избытка мочи полоску следует держать горизонтально для исключения перекрестного загрязнения реактивами из прилегающих зон.
7. Спустя 30-60 с (60-120 с – для лейкоцитов) после погружения полоски в мочу сравнить окраску тестовых зон с окраской соответствующих зон цветной шкалы на пенале и зарегистрировать результат.

При работе на отражательном фотометре (рис. 7.2) диагностическую полоску после удаления избытка мочи помещают в специальный держатель (например, в анализаторах мочи «Urilux», «Clinitek 20, 50», «Pocket Chem UA», «Aution Mini») или укладывают на транспортер (в анализаторах «Miditron», «LabUReader»), или на место считывания результата («Rapimat II»). В некоторых анализаторах («Miditron») нет необходимости в удалении избытка мочи, это происходит в процессе движения полоски на транспортере к фотометру, в котором идет детекция результата. В анализаторе мочи «Aution Mini» существует специальная функция удаления избытка мочи.

Рис. 7.2. Этапы исследования мочи с помощью диагностической полоски на приборе «Pocket Chem UA»:
а – погружение диагностической полоски в образец мочи; б – помещение диагностической полоски, смоченной мочой, в прибор; в – отпечатанный на принтере результат анализа

После помещения полоски в анализатор происходит измерение (метод отражательной фотометрии) и распечатывание результата. Патологические результаты отмечаются особыми пометками, «флагами» (звездочкой, латинской буквой «Н» – от англ. high и др.). При обнаружении хотя бы одного патологического результата повторяют исследование всех компонентов общеклинического анализа мочи химическими методами (например, обязательно проводят количественное определение белка в моче с сульфосалициловой кислотой или другим химическим методом, определение глюкозы гексокиназным или глюкозооксидазным методом на анализаторе глюкозы), а также исследование осадка мочи.

В случае приема аскорбиновой кислоты при работе на анализаторах с полосками, на которых есть тестовая зона для ее обнаружения, появляются «флаги» у результатов обнаружения билирубина, общего белка, глюкозы. Эти результаты не могут быть выданы клиницисту, поскольку могут быть ошибочными вследствие влияния аскорбиновой кислоты. Надо отменить лекарства, содержащие аскорбиновую кислоту, по меньшей мере, на 3 дня, и повторить анализ.

В некоторых анализаторах оператору не приходится извлекать каждую полоску после измерения. В них после анализа диагностические полоски заворачиваются автоматически в рулон фильтровальной бумаги, который затем выбрасывается.

Для обработки и документирования результатов анализа тестов «сухой химии» и иммунохроматографических тестов российская фирма «Синтеко-Комплекс» разработала анализатор рефлектометрический компьютерный видеоцифровой «Видиком». С его помощью и с компьютерными программами «Видеотест», «Алкодиагностика» и «Уродиагностика» результаты анализов, проведенных на этих тестах, подвергаются цифровой обработке, выдаются в виде документа – бланка-ответа (рис. 7.3), полученные данные могут быть сохранены на магнитном или бумажном носителях информации. Анализатор адаптирован под широкий спектр «сухих» тестов и, кроме того, не нуждается в питании от электрической сети, к ответу прилагается изображение полоски (или тест-кассеты) после проведения анализа, денситограмма, оценка контрольных и тестовых зон и результата в целом.

Рис. 7.3. Представление результатов исследования на видеоцифровом комплексе «Видиком»: а — диагностическая тест-кассета с выявившимися тестовой и контрольной зонами; б — денситограмма; в — количественные результаты исследования и их оценка

Отражательные фотометры для анализа мочи на полосках занимают очень мало места в помещении, а анализатор «Pocket Chem UA», работающий на батареях, – массой всего 300 г, размером с ладонь — может помещаться в кармане. Помимо анализаторов для анализа мочи на диагностических полосках, работающих на основе отражательной фотометрии, известны анализаторы, в которых считывание результатов происходит с помощью цифровой фотокамеры («Laura») или видеокамеры и компьютерного анализа изображений.