Определение витаминов и гормонов

Витамины

Витамин B1

Принцип. При окислении витамина В1 феррицианидом калия в щелочной среде, получается тиохром, который экстрагируют количественно изобутиловым спиртом. В ультрафиолетовом цвете раствор тиохрома дает синюю флуоресценцию, яркость которой сопоставляют с окраской эталона витамина В15 окисленного в аналогичных условиях. Учитывая, что моча как таковая дает флуоресценцию, в качестве компенсационного раствора применяют раствор мочи в изобутиловом спирте.

Реактивы.

1. Едкий натр 15%.
2. Феррицианид калия 1%.
3. Изобутиловый спирт.
4. Сульфат натрия, безводный в порошке.
5. Стандартный раствор тиохрома. Из кристаллического витамина Bt приготовляют раствор, содержащий 20 мг/мл аневрина, который можно сохранять 2–3 дня. В разделительную воронку на 25–50 мл берут 1 мл этого раствора, 2 мл едкого натра 15%, (1) и 0,1 мл феррицианида калия 1% (2). Слегка встряхивают, оставляют в покое на 2 минуты, затем экстрагируют, энергично встряхивают с 20 мл изобутилового спирта (3). Спустя 10 минут спирт переводят в центрифужную пробирку и центрифугируют. Изобутиловый спирт отделяют в отдельный флакон, в который добавляют щепотку безводного сульфата натрия (4), затем фильтруют. Этот спиртовый раствор (эталон) содержит 1 цг/мл витамина В*.

Техника.

а) Экстрагирование мочи. В разделительную воронку на 25–50 мл берут 2,5 мл мочи, 10 мл гидрата натрия 15% (1) и 5 мл феррицианида 1% (2). Слегка встряхивают, оставляют на 2 минуты в покое, затем экстрагируют, энергично встряхивая с 20 мл изобутилового спирта (3), разделяют и высушивают спирт сульфатом натрия, как это было показано (5), затем фильтруют; 10 мл анализируемого раствора (а) соответствует 1,25 мл мочи.

б) Приготовление компенсационного раствора. Встряхивают 10 мл мочи с 2 мл едкого натра 15% и 20 мл изобутилового спирта. Отделяют спирт и высушивают так, как было показано выше. 1 раствором можно пользоваться в течение нескольких дней.

в) Определение. Берут 10 мл анализируемого спиртового раствора (а) в пробирку, которую кладут под кварцевую лампу на черном штативе с наклоном в 45°. Появляется синяя флуоресценция. В другой пробирке анализируемый раствор (а) разбавляют в соответствующем соотношении изобутиловым спиртом таким образом, чтобы получилась слабая белая муть, причем флуоресценцию тиохрома наблюдают и определяют без каких либо затруднений. Например, 1 мл анализируемого раствора (0,125 мл мочи) + 9 мл изобутилового спирта. В 3-ю пробирку берут 9,7 мл изобутилового спирта и с помощью микропипетки на 0,5 мл добавляют по 0,1 мл компенсационного раствора (б) до получения белой мути в анализируемом растворе (например, 0,3 мл). Другой микропипеткой на 0,2 мл в эту пробирку добавляют количество стандартного раствора тиохрома (5), необходимое для получения флуоресценции и оттенка окраски в пробирках, одинаковых с анализируемым раствором (а). Если сравниваемый раствор дает ту же флуоресценцию, но имеет более яркий красновато- синий цвет, это означает, что добавленное количество компенсационного раствора не было достаточным. В этом случае, служащий для сравнения раствор приготовляют снова, например, из 9,5 мл изобутилового спирта и 0,5 мл компенсационного раствора.

Расчет. Предположим, что для получения одинаковой флуоресценции было использовано 0,05 мл стандартного раствора тиохрома (5).

Патофизиологические изменения. Выделение витамина Вх в моче за 24 часа в случае смешанного режима, колеблется в пределах от 100 до 500 (лг, изменяясь в довольно широком диапазоне. Эти цифры могут значительно увеличиваться в случае витаминотерапии или богатого витаминного питания, или снизиться, если витамин Вг отсутствует в пище. Авитаминоз Вх может быть обнаружен при внутривенном введении этого витамина и посредством определения выводимого количества в моче. В случае наличия авитаминоза, в моче обнаруживается лишь весьма незначительное количество впрыснутого витамина.
Рабочие, занятые в горячих цехах выделяют за смену 300 мг витамина В, т. е. 15% необходимой суточной дозы в 2 мг.

Витамин PP. Метод Рауль-Крепи

Принцип. После осаждения сульфатом алюминия и гидролиза с соляной кислотой (никотиновая кислота дает в три раза более яркую окраску. Производят реакцию Кенига, состоящую в фиксации бромистого цианогена и аминофенилсульфонамида, с разрывом пиридинового кольца.

Получается продукт желтовато-оранжевого цвета, яркость окраски которого пропорциональна концентрации витамина РР в анализируемом образце.

Реактивы.

1. Сульфат алюминия 5%.
2. Карбонат кальция в порошке.
3. Концентрированная соляная кислота.
4. Бромтимол синий, стартовый раствор 0,04%.
5. Едкий натр 20%.
6. Буферный раствор pH = 6,8. В мерной колбе на 200 мл смешивают 50 мл монокалиевого фосфата 0,2 м. с 24 мл едкого натра 0,2 м и дополняют дистиллированной водой до метки.
7. Цианистый калий 10%.
8. Бромистая вода, насыщенный раствор.
9. Парааминофенилсульфонамид 10% в соляной кислоте 6%.
10. Соляная кислота 50%.
11. Чистая никотиновая кислота (стандартный раствор). Растворяют 100 мг никотиновой кислоты в 100 мл дистиллированной воды. Раствор содержит 1 000 fxr/мл никотиновой кислоты. Перед употреблением, путем разбавления приготовляют стандартный раствор на 50 (хг/мл никотиновой кислоты.

Техника.

а) Гемолиз и осаждение. К 5 мл сыворотки или цельной крови добавляют 35 мл дистиллированной воды, встряхивают, затем образец кладут в холодильник при –10° или в охлаждающую смесь льда с солью, в которой его оставляют на 1 час. Затем осторожно нагревают до получения однородной жидкости, что означает, что гемолиз был полным. Оставляют в покое на 1 час, добавляют 10 мл сульфата алюминия 5% (1), встряхивают, оставляют еще на 30 минут, добавляют 1 г карбоната кальция (2), встряхивают и комки размельчают стеклянной палочкой. Кипятят с орошением до тех пор, пока пена, вызванная выделением СОа, доходит почти до горлышка колбы. В этот момент кипячение прекращают, содержимое колбы взбалтывают для отделения приставших к стенкам частиц и быстро фильтруют, отмечая точный объем фильтрата. (Вообще V = 35 мл).

б) Гидролиз и нейтрализация. Прозрачный фильтрат переводят в чашку, которую кладут в кипящую водяную баню и объем сокращают до 10 мл. Удаляется осадок сульфата кальция, отложившийся на стенках чашки, затем фильтруют, споласкивая чашку 2–3 мл горячей дистиллированной водой. К прозрачному фильтрату добавляют концентрированную соляную кислоту 10%ч(3) и кипятят с орошением в продолжении двух часов. После охлаждения жидкость переводят в мерную колбу на 25 мл, добавляют 1–2 капли бромтимола синего 0,04% и нейтрализуют едким натром 20% (5) до получения зеленоватого цвета, соответствующего значению pH = 6,8. Затем добавляют 1,5 мл буферного раствора с pH = 6,8 (8), дополняют бидистиллированной водой до метки и фильтруют.

Реакция Кенига. В 3 пробирки А,В,С берут по 5 мл нейтрализованного раствора, затем добавляют 0,2 мл (10 (хг) стандартного раствора, разбавленного никотиновой кислотой в пробирку В и по 0,2 мл дистиллированной воды в пробирки А и С. Все три пробирки погружают в водяную баню при 80° в течение нескольких минут для получения одинаковой температуры, затем в пробирки А и В добавляют по 1 мл цианистого брома (приготовляемого непосредственно перед употреблением, добавлением к бромистой воде раствора цианистого калия 10%, по каплям до обесцвечивания), а в пробирку С добавляют 1 мл дистиллированной воды. Пробирки погружают на 2 минуты в водяную баню при 80°, затем охлаждают струей воды, оставляют на 15 минут в темноте, затем в каждую из них добавляют по 0,5 мл смеси, состоящей из 3 мл аминированного реактива (9) и 2 мл соляной кислоты 50% (10). Спустя 1 минуту затухания отсчитывают на фотометре Пульфриха с синим фильтром на 470 м(х и кюветой на 20 мм. Отсчет повторяют спустя 5, 10 и 15 минут, причем для расчета берут максимальные затухания.

Гормоны

17-кетостероиды. Метод Каен-Сальтера

Принцип основан на реакции Циммерманна: посредством метиленовой группы (СН2), активированной соседней кетоновой функцией, 17-ке- тостероиды дают с метадинитробензолом в щелочной среде продукт конденсации розово-фиолетового цвета, причем интенсивность окраски пропорциональна количеству находящегося в образце вещества.

Реактивы.

1. Концентрированная соляная кислота.
2. Серный эфир.
3. Едкий натр 4%.
4. Безводный сульфат натрия.
5. Абсолютный спирт.
6. Раствор очищенного метадинитробензола 2% в абсолютном спирте. Раствор сохраняют не более двух недель в холодильнике.
7. Едкий калий 2,5 н в бесцветном и прозрачном абсолютном спирте. Раствор сохраняют не более одной недели в холодильнике.
8. Калибровочную кривую строят, используя серию стандартных растворов, содержащих ацетат дигидроизоандростерона в следующих концентрациях (выраженных в fir/мл): 250, 500, 750, 1000, 1 250, 1 500, 1 750 и 1000. Эти стандартные растворы обрабатывают тем же реактивом и производят расчет на фотоколориметре, также как и для анализируемого образца.

Если вещество окрашено, его следует очистить по способу Анри и Тевене: растворяют 40 г в 150 мл спирта 96°, слегка нагревая до 40° на водяной бане. После растворения добавляют 100 мл едкого натра 2 н, энергично встряхивают и спустя 30 минут осаждают метадинитробензолом, добавляют 6 000 мл дистиллированной воды, оставляют на несколько часов в холодильнике. Фильтруют в воронке Бюхнера, затем промывают 2 000 мл горячей воды. Растворяют при нагревании (40°) сухой осадок в 250 мл спирта 96°, добавляют 5 г активного угля и фильтруют. Сухой осадок повторно растворяют при нагревании (40°) в 100 мл спирта 96°. Оставляют для медленного охлаждения, затем помещают в холодильник до следующего дня, для того, чтобы способствовать кристаллизации. Кристаллы собирают и высушивают в эксикаторе.

Техника.

а) Сбор материала. Мочу за 24 часа собирают в одну посуду, а если она собрана в несколько сосудов, ее подвергают гомогенизации. Собирание мочи у мужчин можно производить в любое время, в то время как у женщин исключается менструальный период, включительно 2–3 дня до и после менструации. За три дня до взятия образца больной не принимает никаких других медикаментов, помимо антибиотиков или кортикотерапевтических препаратов, не препятствующих колориметрированию, а накануне пьет жидкость в нормальных условиях (не чрезмерно).

б) Гидролиз.Измеряется и отмечается суточный объем мочи. Из этого количества берут 100 мл в колбу Эрленмейра на 500 мл, оснащенную обратным холодильником и добавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты (1), затем кипятят 10 минут – время, необходимое для гидролиза. Оставляют для охлаждения или охлаждают струей воды. После охлаждения фильтруют, споласкивая колбу и фильтр несколькими миллилитрами дистилированной воды.

в) Экстракция. Гидролизированную и отфильтрованную мочу переводят в разделительную воронку на 200–300 мл и добавляют 300 мл эфира (2). Встряхивают в течение 5 минут для экстракции, причем необходимо следить за тем, чтобы пробки не выскочили из воронки (их следует придерживать, рукой, причем от времени до времени одну из них открывают для вывода эфирных паров, создающих в воронке некоторое давление). После встряхивания воронку оставляют на 2–3 минуты в вертикальном положении для того, чтобы эфирный слой всплыл на поверхность. Мочу переливают в сосуд, в котором проводился гидролиз, а эфирный экстракт собирают в другую посуду. Мочу снова берут в воронку и экстрагируют повторно с 30 мл эфира, однако встряхивая лишь 3 минуты. Мочу собирают в ту же колбу, как указано выше, а эфирный экстракт добавляют к первому экстракту. И наконец, экстракцию повторяют третий раз, опять с 30 мл эфира, причем встряхивают лишь 2 минуты. Мочу из разделительной воронки выбрасывают, а третий эфирный экстракт остается в воронке, причем к нему добавляют первые два экстракта. Таким образом соединенные эфирные экстракты промываются два раза в разделительной воронке с 15 мл едкого натра 4% (3), встряхивая несколько минут. Едкий натр выбрасывают, а эфир остается в разделительной воронке. Затем его промывают дважды по 30 мл дистиллированной воды, которую выбрасывают. Эфирный экстракт переводят из воронки в колбу на 100–150 мл и высушивают, добавляя несколько граммов безводного сульфата натрия (4). Переводят в другую колбу и выпаривают эфир до получения небольшого количества сухого экстракта. Если возможно, выпарка эфира производится дистилляцией, причем колбу с экстрактом погружают в водяную баню при 80–90°. Таким образом можно рекуперировать наибольшую часть эфира для повторного использования при экстракции. Осадок в колбе снова растворяют в 5–6 мл эфира, который переводят в бутылочку из-под пенициллина или стрептомицина и затем выпаривают эфир до-суха, выдерживая бутылочку в водяной бане при 70–80°. Сухой экстракт, темно-коричневого цвета, используют для колориметрического определения, причем можно хранить его в течение нескольких месяцев в прохладном месте, если бутылочка хорошо закупорена пробкой.

г) Фотометрирование. Осадок из бутылочки растворяют в 1 мл абсолютного спирта (5) и из этого спиртного экстракта берут 0,1 мл в пробирку, затем добавляют 0,1 мл раствора метадинитробензола 2% (6) и 0,1 мл едкого калия 2,5 н (7). Параллельно приготовляют слепой контрольный образец в другой пробирке, заменяя спиртный экстракт 0,1 мл абсолютного спирта, который титруют также как и анализируемые образцы. Пробирки выдерживают в течение 90 минут при 25° в термостате или в водяной бане, от времени до времени взбалтывая, после того как был добавлен едкий калий. Затем, в каждую пробирку добавляют по 5 мл спирта 96° и производят отсчет на фотоколориметре Пульфриха с зеленым фильтром на 530 мх и кюветой на 10 мм, используя абсолютный спирт в качестве компенсационной жидкости. Затухание контрольного образца вычитают из значения затухания исследуемого образца, после чего подсчитывают результат, пользуясь калибровочной кривой. Полученные значения соответствуют 100 мл мочи. Для того, чтобы получить значение, соответствующее суточной моче, необходимо умножить на соответствующую цифру.

Патофизиологические изменения. Нормальными значениями являются 7–10 мг/сутки для женщин и 10–15 мг/сутки для мужчин. Следовательно, женщины выделяют примерно на 30% меньше мужчин, так как у этих последних 1/3 секретируемого количества гормона происходит из яичка, в то время как у женщин все количество гормона вырабатывается кортиконадпочечником.

Дети до 7-летнего возраста выделяют 1,3 мг/сутки, в возрасте от 7–12 лет – 4мг/сутки; вместе с тем старики также выделяют весьма незначительное количество 17-кетостероидов. Выделение 17-кетостероидов снижается во время сна, а также при усилиях и утомлении и увеличивается при бессоннице. И наконец, на выделение 17-кетостероидов влияют метеорологические факторы.

Выделение 17-кетостероидов существенно снижается при некоторых гипофизарных заболеваниях (болезнь Симмондса), достигая 0,5 мг/сутки. Кроме того, оно снижается при болезни Аддисона до 0,5–2 мг/сутки. При недостаточности яичка или у кастрированных, секреция 17-кетостероидов снижается на 1/3 нормального количества. И наконец, 17-кетостероиды снижаются при ряде других болезней, как например: затяжные формы цирроза, туберкулез, ревматический полиартрит и язвенный колит.

Выведение 17-кетостероидов увеличивается при: опухолях яичка (до 1 500 мг/сутки), опухолях кортиконадпочечника (до 2 100 мг/сутки), а также при состояниях кортиконадпочечной гиперфункции: адреносиндром половых органов (до 100 мг/сутки) и синдром Кушинга, при котором они постоянно повышены, не достигая однако высоких значений. Кроме того, 17-кетостероиды значительно повышены при вирилизующих опухолях яичника и слегка увеличены при акромегалии.

Феносстероиды

Принцип. Фенолстероиды с реактивом фенол-серная кислота дают красную окраску (красный Кобера) с максимальной асборбцией в зеленом спектре.

Реактивы.

1. Концентрированная соляная: кислота.
2. Фосфорновольфрамовая кислоты 10%.
3. Раствор аммиака 5%.
4. Серный эфир.
5. Кристаллический карбонат натрия 9%.
6. Раствор едкого натра н.
7. Соляная кислота 20%.
8. Этиловый спирт.
9. Фенол-серная кислота: на водяной бане при 60° расплавляют чистый перегнанный фенол, затем постепенно вводят в чистую серную кислоту (выдерживаемую при низкой температуре) в соотношении 3,6 частей фенола на 5,6 частей серной кислоты. Реактив можно сохранять в течение нескольких недель на льду в герметически закупоренной коричневой бутылке.
10. Калибровочную кривую строят, используя серии стандартных растворов, содержащих в спиртовом растворе чистый эстрон в следующих концентрациях (выраженных в [л.г/мл): 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5; 20 и 25. Из каждой концентрации берут по 1 мл, обрабатывают теми же реактивами и производят отсчет на фотоколориметре, так же как и для анализируемого образца.
11. Смесь вода-ацетон в равных частях.

Техника.

а) Сбор материала. Во время беременности собирают мочу за сутки на 10 каплях толуола или хлороформа. Если речь не идет о беременности, то предпочтительно собирать смесь мочи за 3 последовательные ночи. В этом случае больная опорожняет пузырь в 20 часов и выбрасывает мочу. Затем, в той же посуде, собирают мочу за 3 последовательные ночи, включительно ту мочу, которая была выделена спустя 1/2 часа после того, как больная проснулась утром, Отмечается время, когда моча была выброшена к концу дня и время ее собирания утром. Подсчитывают продолжительность собирания, которая не должна превышать 30 часов, причем результат выражается за сутки. На время собирания мочи, из питания больной необходимо исключить парей, капусту и шпинат. Кроме того больная не должна принимать лекарственных средств, содержащих камфору и ментол.

б) Фосфорно-вольфрамо-соляно-кислый гидролиз применяют в случае, когда моча содержит менее 1 000 мг/л фенолстероидов (помимо или в течение первых 3 месяцев беременности). Этот метод предоставляет возможность удаления большинства пигментов и смол, содержимых эфирным экстрактом.

Объем мочи измеряют и записывают. К 300–500 мл мочи добавляют 10% концентрированной соляной кислоты (1) и 2% раствора фосфорновольфрамовой кислоты 10% (2). Кипятят с орошением в течение 1 часа, охлаждают струей воды, затем выдерживают 2–3 часа на льду. Фильтруют, осадок снова растворяют в 20–40 мл раствора аммиака 5% (3) и подкисляют несколькими каплями концентрированной соляной кислоты (4); (индикатор – лакмусовая бумажка). Образовавшийся осадок фильтруют и промывают дважды по 5–10 мл дистиллированной водой. Оба фильтра и промывочные воды соединяют для проведения экстракции.

Солянокислый гидролиз применяют в течение последних 6 месяцев беременности, когда концентрация фенолстероидов превышает 1000 мг/л. В этом случае окрашенные примеси более или менее влияют на определение фолликулина.

К 300–500 мл мочи добавляют 15% концентрированной соляной кислоты и кипятят с орошением в течение 1 часа, а затем обрабатывают как указано выше. Начиная с 10-ой недели беременности, используют 100–200 мл мочи, а после 20-ой недели достаточно 50 мл.

г) Экстракция. Гидролизированную мочу экстрагируют 4 раза, применяя каждый раз по 50 мл серного эфира (4) ; эфирные экстракты соединяют вместе и дважды промывают по 50 мл карбоната натрия 9% (5), затем трижды по 25 мл дистиллированной воды. Эфир концентрируют до 50 или 100 мл, в зависимости от взятого объема мочи, затем экстрагируют 3 раза, используя 60 мл едкого натра н (6). Щелочные растворы смешивают и подкисляют до рН=3 (переход конго красного в синий цвет) соляной кислотой 20% (7). Экстрагируют три раза следующими количествами серного эфира: в 1-ый раз – 90мл, во 2-ой раз – 60 мл и в 3-ий раз–30 мл, встряхивая по 3 минуты. Эфирные экстракты смешивают и промывают дважды по 45 мл дистиллированной водой. Выпаривают досуха посредством дистилляции, осадок оставляют на 12 часов в эксикаторе, затем растворяют в 2,5 мл этилового спирта (8).

д) Определение. Спиртовой экстракт разделяют в гемолитические пробирки, взяв в каждую пробирку по 0,2 1 мл экстракта для определения у небеременных женщин или находящихся в первых месяцах беременности и по 0,1–0,5 мл –для случаев беременности в более поздний период, а именно таким образом, чтобы в каждой пробирке находилось по 2–10 мг фолликулина. Если это количество не находится в пределах 2-20 мг, определение следует повторить по первому приближению. Спиртовой экстракт выпаривают досуха, затем добавляют 0,4 мл реактива фенол-серная кислота (9), хорошо закупоривают пробкой, обернутой в оловянную или свинцовую фольгу, погружают на 10 минут в кипящую водяную баню, встряхивая пробирку по истечении 1 минуты после погружения в воду и затем еще 2 раза по 1 минуте с трехминутными промежутками. До колориметрирования (обычно через несколько часов) пробирку держат в холодильнике. Затем добавляют 0,35 бидистиллированной воды и погружают на 1 минуту в кипящую водяную баню, после чего охлаждают в течение 30 секунд в воде со льдом и добавляют 1,25 мл охлажденной смеси вода-ацетон (10). Пробирку закупоривают пробкой, переворачивают для надлежащей гомогенизации и спустя 1 минуту после добавления последнего реактива, отсчитывают оптическую плотность на фотометре Пульфриха с зеленым фильтром на 530 м(л и кюветой на 10 мм, используя гидро-ацетоновую смесь в качестве компенсирующей жидкости. Хорошо закупоренную пробирку оставляют на сутки в темноте, затем снова производят отсчет на фотометре. За это время розовая окраска, вызываемая фолликулином (эстрон + эстриол + эстрадиол) исчезает, так что слабая окраска раствора является только следствием хромогенов (пигменты, смолы и др.), дающих атипичную реакцию Кобера. Разница между обоими отсчетами представляет собой, таким образом только оптическую плотность фенолстероидов
которую относят к калибровочной кривой. При расчетах учитывается общее количество мочи, а также количество взятое для определения, причем результат выражается в мг фенолстероидов/сутки.

Примечание. Для того, чтобы удалить хромогены и тотчас же провести определение фолликулина, Аллен, основываясь на том, что это вещество дает красную окраску с максимальной абсорбцией при 510 ми предложил производить отсчет оптической плотности при трех различных длинах волны, а именно: 510 мл, 450 мл и 550 мл.

Результат относят к калибровочной кривой, установленной в разных условиях, то есть отсчитывая оптическую плотность при вышеприведенных трех длинах волны, для каждой концентрации стандартного раствора эсгрона.

Отсчет следует производить весьма быстро, а именно; первый – через 45 секунд, второй – через 60 секунд, а третий – через 90 секунд после добавления водно-ацетонового раствора.

Патофизиологические изменения. В нормальных условиях фенолстероиды изменяются от 20–35 мг/сутки у мужчин, а у женщин – в зависимости от фазы менструального цикла, а именно: 30 мг/ сутки в фолликулярной фазе и 70 мг/сутки в лютеальной фазе, причем количество свыше 150 мг/сутки считается гиперфолликулинемией.

Выделение фенолстероидов увеличивается при опухолях яичника, а также при беременности, при которой наблюдаются изменения в пределах 150–1000 мг/сутки в течение первых трех месяцев; 1000–5000 мг/сутки между 3 и 6 месяцами и 5000–6000 (лг/сутки между 6 и 8 месяцами, достигая в предродовой период до 10 000 мг/сутки и затем после родов прогрессивно снижаясь до исходного значения. В случае если фенолстероиды снижаются во время беременности менее 150 мг/сутки, существует угроза аборта, а количество в 75 мг/сутки является почти неопровержимым доказательством смерти плода.

Прегнандиол. Метод Гутермана, видоизмененный Ордынецом

Принцип. После гидролиза мочи и отделения прегнандиола экстрагированный продукт обрабатывается концентрированной серной кислотой, окисляющей альдегидную группу в кетон; в результате чего получается соединение оранжево-бурого цвета, которое может быть подвергнуто колориметрированию.

Реактивы.

1. Толуол для анализа.
2. Концентрированная соляная кислота для анализа.
3. Едкий натр 0,1 н.
4. Едкий натр 2% в абсолютном метиловом спирте 2%. В начале приготовляют более концентрированный раствор: 4–8%. Фильтруют для того, чтобы удалить карбонат, затем разбавляют и определяют точную концентрацию титрованием серной кислотой 0,1 н. Раствор может быть использован лишь в течение одной недели.
5. Ацетон для анализа.
6. Абсолютный этиловый спирт.
7. Концентрированная серная кислота для анализа.
8. Калибровочную кривую строят, используя серию стандартных растворов, содержащих от 10 до 100 мг/мл прегнандиол-натрия в абсолютном спирте. Эти стандартные растворы обрабатываются теми же реактивами и затем производят отсчет на фотоколориметре, так же как и для анализируемого образца.

Техника.

а) Сбор материала. Мочу собирают за сутки на 21-ый день менструального цикла или берут смесь за две последующие ночи, на 0,02 г цианистой ртути в растворе 1% и 1 мл хлороформа. В этом случае мочу собирают так, как было показано при определении фенолстероидов.

б) Гидролиз. Измеряют и отмечают объем мочи. К 100 мл мочи добавляют 50 мл толуола (1), 10 мл концентрированной соляной кислоты (2) и 2 стеклянные бусинки, затем кипятят в течение 15 минут на электрической плитке.

в) Экстракция. После охлаждения переводят в разделительную воронку, причем нижний слой (моча) выбрасывают. Толуол промывают, а также промывают эмульсию, получаемую с 15 мл едкого натра 0,1 н (3) и дважды по 15 мл дистиллированной воды. Толуол и эмульсию переводят в колбу Эрленмейера на 150 мл и добавляют 2 стеклянные бусинки, после чего кипятят. После испарения воды продолжают кипятить на умеренном огне и добавляют 10 мл едкого натра 2% (4). Смесь выпаривают до получения гранулированного осадка, в котором присутствует приблизительно половина объема исходного толуола. Фильтруют в горячем состоянии с помощью вакуум-насоса через фильтр Пирекс до средней пористости. (Если фильтрат имеет розово-оранжевый или бурый цвет, добавляют 10 мл едкого натра 2% и снова выпаривают, до получения желтого или желто-зеленого фильтрата). Осадок промывают 15 мл горячего толуола, который соединяют с первым фильтратом. Выпаривают досуха, затем пропускают поток воздуха для удаления следов толуола.

г) Осаждение прегнандиола. Осадок растворяют в 5 мл, ацетона (5), нагревая до полного растворения, затем медленно добавляют вее время перемешивая, 20 мл едкого натра 0,1 н. Кипятят в течение 3 минут и оставляют на 1 час в холодильнике (5°).

д) Отделение прегнандиола. Фильтруют с водоструйным насосом через фильтр средней пористости, затем осадок 15 мл дистиллированной воды. Осадок растворяют в 10 мл горячего абсолютного этилового спирта (6), который собирают в отдельную посуду. Экстракт выпаривают досуха.

е) Получение окраски. Осадок растворяют в 10 мл концентрированной серной кислоты (7), затем оставляют на 1 час для получения окраски. Берут точно отмеренное количество и разбавляют до 5 мл концентрированной серной кислотой, затем оптическую плотность отсчитывают на фотометре Пульфриха с синим фильтром на 470 м(А и кюветой на 10 мм, используя серную кислоту в качестве компенсирующей жидкости. Относят к калибровочной кривой, учитывая общее количество мочи и количество, взятое для анализа, причем результат выражают в мг прегнадиола/сутки.

Патофизиологические изменения. Прегнандиол появляется в период половой зрелости и является весьма точным и ценным тестом определения активности желтого тела. В лютеальной фазе взрослые женщины выделяют 4–6: мг/сутки прегнандиола (2 мг на 14-ый день и 6–8 мг на 23-ий день менструального цикла). Во время беременности выделение прегнандиола увеличивается с 6 мг в 1-ом месяце, доходя до 60 мг в 9-ом месяца.

Выделение прегнандиола спадает ниже нормального значения при: первичной и вторичной аменорее, бесплодии, менопаузе, агенезии яичника, кастрации, а также ряде заболеваний печени. Кроме того, оно значительно понижено, доходя почти до нуля при цикле ановуляции, будучи нормальным при овуляции. В случае беременности снижение выделения прегнандиола свидетельствует о недостаточности лютеальной функции, указывая таким образом на возможность аборта.

Выделение прегнандиола значительно увеличивается при ряде кортиконадпочечниковых опухолей (75–100 мг), адренополовом синдроме и др.